利用抑制消减杂交分离受褐飞虱取食下调的水稻基因

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1、3期袁红雨等:利用抑制消减杂交分离受褐飞虱取食下调的水稻基因305利用抑制消减杂交分离受褐飞虱取食下调的水稻基因*袁红雨祝莉莉唐　明何光存(武汉大学生命科学学院，植物发育生物学教育部重点实验室，武汉430072)摘要：为了分离受褐飞虱取食抑制的水稻基因，采用下部茎干变黑，整株死亡。尽管褐飞虱对水稻的抑制消减杂交的方法，以正常生长的水稻幼苗为目标危害是多方面的，但褐飞虱连续取食，导致水稻群体，以褐飞虱胁迫32h的水稻幼苗作为对照群体，构植株养分亏缺是造成植株死亡的主要原因，所以建了含200个重组质粒的SSHcDNA文库

2、。随机挑选水稻对褐飞虱的反应整合了植株对养分亏缺的反50个重组质粒进行反向Northern差异筛选后，再经Northern杂交验证，得到2个受褐飞虱取食抑制的基应，而以往在研究植物对昆虫的防御反应时缺乏因：一个是Lhca，编码水稻光系统I天线蛋白；另一个对养分亏缺方面的考虑。基因(BpHd002)与肌苷-5’-单磷酸脱氢酶基因有同源　　被昆虫取食后，植物体内的代谢活动发生显性。以BpHd002为探针筛选水稻幼苗cDNA文库分离著的变化，比如光合速率下降，植物体把氮源和碳出该基因的全长cDNA(BpHd002A)。其长

3、度为1285源从生长代谢调配给防卫反应(Watanabe和bp，含有一由519bp组成的完整的阅读框，编码的蛋Kitagawa2000)。分离和鉴定受褐飞虱取食调节的白质具有两个CBS结构域。基因有助于理解植物防卫反应的机制。关键词：抑制消减杂交；褐飞虱；水稻；肌苷-5’-单磷酸脱氢酶；BpHd002A1材料与方法中图分类号：Q741.1　材料　　分子生物学的理论和技术不断发展和完善，　　在直径为10cm的塑料杯内均匀播种20粒水使人们能够从分子水平上研究植物与昆虫的相互作稻(OryzasativaL.)明恢63的种

4、子。当水稻幼苗长用机制。植物体对昆虫取食所做出的反应十分复到两叶一心时，每一幼苗上接10头左右2～3龄杂,昆虫取食不可避免地对植物体产生机械伤害，褐飞虱若虫，并把杯子及幼苗用通风良好的网罩伤害反应在植物体抵御昆虫取食的反应中处于中心罩上。接虫后，每隔一定时间剪取水稻幼苗，并地位(Kessler和Baldwin2002)。昆虫取食时产生立即浸泡在液氮中，用于RNA的提取。的专一性引发子(elicitor)会改变植物体的伤害反应,1.2总RNA及mRNA的提取使之能更有效地抵御昆虫的取食(Reymond等　　总RNA及m

5、RNA的分离提取按照TRIzolRNA2000)。另外，昆虫取食时在植物体上产生的伤提取试剂(GibcoBRL)及MESSAGEMAKER口会成为微生物侵染的部位，而且某些植食性昆ReagentAssembly试剂盒(GibcoBRL)说明书进行。虫又携带病原菌，这也是植物体内参与调节植物1.3SSH实验体与病原菌以及植物体与昆虫相互作用的信号转导SSH实验采用ClotechPCRcDNAsubtraction途径相互重叠的原因(Moran和Thompson2001)。kit。基本步骤如下：①分别提取对照群体＋烟草被

6、烟草天蛾取食时发生显著变化的5个基因，(driver)和目标群体(tester)两种幼苗的poly(A)在拟南芥中却不受菜粉蝶取食的影响(HermsmeierRNA，并反转录成cDNA；②用RsaI把两种等2001)。这种植物体与昆虫的相互作用在物种间cDNA平均切成<500bp的片断；③把目标群体的差别又进一步增加了问题的复杂性。cDNA均分成2份，分别连上不同的接头，然后　　褐飞虱(brownplanthopper，BPH)是水稻的重再分别与变性过量的对照群体cDNA杂交；④杂要害虫，食性单一，只能在水稻和普通野

7、生稻上取食和繁殖后代。以成虫、若虫群集方式在稻丛2003-09-26收到，2004-02-16接受。国家自然科学基金项目(No.30170085)资助。基部吸食汁液，被害部位呈长形棕色斑，严重时*通讯作者(E-mail:gche@whu.edu.cn;Tel:027-87682384)。306植物生理与分子生物学学报30卷交后，将两份样本混合，再继续与变性的对照planthopperdepressed)，它们代表着受褐飞虱取食群体cDNA杂交；⑤经抑制PCR和巢式PCR扩抑制的基因。还有一个克隆对两种材料的杂交信增，

8、再将扩增产物插入pT-Adv载体，转化大肠号相近(图略)。其余3个克隆与两种材料杂交均无杆菌TOP10F’获得SSHcDNA文库；⑥通过阳性信号(图略)。蓝白斑实验从SSHcDNA文库中筛选出含有插入片断的克隆。1.4　差示筛选SSHcDNA文库　　从SSHcDNA文库中随机挑取50个重组子，分别编号，抽提质粒，点印于尼龙膜上，制备2套重复拷贝