运用dsrna体外饲喂及转基因水稻沉默褐飞虱基因之研究

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1、运用dsRNA体外饲喂及转基因水稻沉默褐飞虱基因之研究1前言1.1褐飞虱对水稻的危害揭飞風Mlqparvatcilugens(Stil)属半翅目飞虱科昆虫，是不完全变态昆虫，其一生经历卵期、若虫期及成虫期三个生长时期，其中若虫期又分为5个龄期。初孵若虫为淡黄色，随后发育成褐色的末龄若虫，成虫为淡褐色或暗褐色（刘爱红等，2008)。褐飞風喜产卵于抽穗扬花期稻株上，主要以卵块形式在水稻植株下部叶鞘内产卵，卵呈香蕉型，卵期约为7-11天。褐飞虱偏好温湿的环境，26-28°C最有利于它的生存及发育，过低或过高的温度都会很大程度地影响卵的孵化

2、、若虫生存以及成虫的繁衍。温度适宜的初夏和晚秋这样的年份就可能会成为褐飞虱大量暴发的年份，同时80%左右的相对湿度利于褐飞風的生存与繁殖（程家安等，1992;戴华国等，1997;李如铎，1984)。褐飞風的口器属刺吸式口器，若虫和成虫都能对水稻产生危害，它们多在稻丛基部莲杆剌吸汁液而消耗植株的养分，其唾液腺的分泌物具有毒性，从而使水稻因中毒而生长迟缓且营养不良（吕仲贤，1999;Parejareametal.,1984)。褐飞風产卵时，其产卵器能够划破植株下部莲杆，使莲杆内水份流失，同时由于褐飞虱的刺吸式取食，大量不规则的伤痕就此残留在水稻

3、植株上，影响水份和养份的运输，致使水稻生长迟缓。虫害严重时，大量的蜜露容易使稻丛基部滋生霉菌而变黑口，致使水稻成片倒伏，出现虱烧现象，甚至绝收。此外褐飞虱还传播两种病毒（草状丛矮病和齿叶矮缩病）对水稻产生危害（Jenaetal.，2006)。褐飞虱属于远距离迁飞性害虫，有着很强的环境适应性，在适合的外部因素诱导下其极易暴发成灾（胡国文等，1996;Heinrichsetal.,1994)c20世纪后叶随着高产耐肥杂交水稻品种的推广和耕作栽培制度的转变，同时化学农药的滥用使生态环境遭到了破坏，形成了有利于褐飞虱发生的生态环境因素，使其迅速跃升

4、为亚洲各稻区的主要害虫（丁克坚等，1998;程遐年等，2003)。而在我国，由于当家品种缺乏抗性、褐飞虱抗药性的增强、气候及褐飞虱生物型变异等原因，全国褐飞虱的发生面积逐年增大，每年造成稻谷产量损失高达数十亿公斤。最近几年，我国各稻区褐飞風虫量达到防治指标的稻田面积在35%以上，个别地区达到100%，重发区有些田块的百丛虫量超之前RNAi先后经历了协同抑制(cosuppression)(Fukusakietal.，2004;Guru,2000)、消除作用（基因压制，quelling)(Cogoni,2001;Romano,1992)。最先观

5、察到由RNA介导的基因沉默现象要追溯到20世纪90年代初期，研宄者为了使花的颜色更加鲜艳，将多个拷贝的紫色素基因转导到矮牵牛中，之后出现了令人费解的现象：花的颜色非但没有变的更鲜艳，反而一些转基因植株的花色变成了白色。这一现象说明体外转入基因的产物与植物内源基因的产物都未行使功能或者这两种产物之间产生了共抑制（Jorgensen，1990;Napolietal.,1990)。这种企图通过转基因使作物产生更多相应基因的产物但实际上其产物反而减少的现象叫做转录后的基因沉默（PTGS)。这种现象并不仅仅存在于植物中，Romano和Macino(1

6、992)将合成类胡萝卜素所需的基因导入野生型粗糖链孢霉(Meurosporacrassa),结果导致30%的转化霉菌自身基因的失活。Macino和Cogoni将这种通过转基因抑制相应内源基因表达的基因沉默现象称为消除作用。1995年在秀丽线虫中开展了类似的研宄，Guo和Kemphues向秀丽线虫中注射了其内源par-1基因的反义RNAs,这些反义RNAs可以与其相对应基因的mRNA结合而阻断转录，同时正义链RNAs(内源IE基因的niRNA)作为阴性对照。令人感到无比惊奇的是，在注射了正义RNAs的线虫中得到了与注射反义RNAs致的结果，即

7、正义和反义RNAs都抑制了IE标基因的表达（GuoandKemphues，1995)。直到三年后，Fire和Mello将正义和反义链合在一起检测两者之间的协同效应时才揭开了上述现象的神秘面纱（Fireetal.，1998),他们发现dsRNA在触发基因沉默上比正义或者反义链有着十倍甚至百倍的效力。2材料与方法2.1实验材料菌株：大肠杆菌CEscherichia,coli)菌株DifJa和根癌农杆菌菌株为本实验室保存和提供。载体：干涉表达载体PDS1301由本室袁斌博士改造和保存，该载体是将载体、PMCG161(McGinnisetal.,2

8、005)中产生双链RNA发卡结构的部分平行转移到双元载体pCambial301上所得。候选基因：本实验室已通过转录组测序获得了水稻褐飞虱、灰飞虱以及白背飞虱的转录组数据。在此转录