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1、华南理工大学学报(自然科学版)第31卷JournalofSouthChinaUniversityofTechnologyVol.31No.122003年12月(NaturalScienceEdition)December2003文章编号:1000-565X(2003)12-0046-05*一种改进的漆酶酶活检测方法何为詹怀宇王习文伍红(华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室,广东广州510640)摘要:以2,2c-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸铵)(简称ABTS)为漆酶A、B的底物,采用UV-2201型紫外-可见分光光度计连续记录酶反应在25e,420nm波长下的时间历程曲线,并求取最
2、初部分的斜率以计算漆酶酶活的方法.该方法直观、方便、准确且可靠.在25e的0.04mol/LBritton-Robinson缓冲溶液中,漆酶A、B的最适pH值分别为4.0和4.5.在25e最适pH值的Britton-Robinson缓冲液中,由双倒数作图法求-5-5得漆酶A、B的米氏常数Km分别是6.64@10mol/L和2.21@10mol/L,漆酶A、B的最大米氏反应速度Vmax分别是1425Lmol.(L#min)和325Lmol.(L#min).漆酶A、-1-1-1-1B的酶活分别为2299Lmol#min#L和1148Lmol#min#L.关键词:漆酶;酶活力;时间进程曲线+中图分
3、类号:Q554.9文献标识码:A漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化还物,在相同条件下,用ABTS测得的漆酶酶活比用[8.9]原酶,主要来源于漆树和白腐菌.1990年,Bourbon-丁香醛连氮测得的要高.[1]nais和Paice首次报道漆酶与ABTS共存时能氧文中建立了以ABTS为底物测定漆酶酶活的化非酚型木素模型化合物,还可以用于脱除纸浆中方法:用UV-2201型紫外-可见分光光度计的[2][3]的残余木素.Call报道漆酶和1-羟基苯并三TIME-COURCE程序连续记录酶反应的时间历程唑(简称HBT)作用于纸浆,能脱除50%的残余木曲线,并求取最初部分的斜率以计算漆酶酶
4、活.该方素.漆酶和介体(ABTS、HBT等)构建的漆酶/介体法是用光度法测定漆酶酶活的改进方法.还由此方体系(简称LMS)具有替代传统含氯漂白的潜在可法检测了漆酶的最适pH值、米氏常数Km和最大能性.国内外都在进一步研究LMS用于纸浆的生米氏反应速度Vmax.[4~7]物漂白.快速而准确地检测漆酶酶活是筛选产漆酶菌株1材料和方法及LMS生物漂白的基础.常用光吸收法检测漆酶[8,9]1.1漆酶酶样酶活,常用的底物是ABTS、丁香醛连氮、邻甲联漆酶酶样A、B由诺维信(中国)有限公司苯胺和愈创木酚.邻甲联苯胺、愈创木酚与漆酶反应(Novozymes,China)提供.的米氏常数大,所生成产物的摩尔
5、吸光系数较[8,9]1.2主要试剂与仪器小,用邻甲联苯胺和愈创木酚检测漆酶酶活的灵敏度小,所测得的漆酶酶活低,国内外近年来已较主要试剂为1mmol/LABTS,ABTS为美国Sig-少采用.相比于丁香醛连氮,ABTS是漆酶的最适底ma公司产品,精确称取0.1372gABTS,用蒸馏水定容至250mL,置于棕色瓶备用;Britton-Robinson缓冲溶液由Ñ液和Ò液按比例配成,其中Ñ液为0.04收稿日期:2003-05-22*基金项目:国家自然科学基金资助项目(20176015);教育mol/L混合酸[2.71mL85%(w)正磷酸+2.36部博士点基金资助项目(2000056101)mL
6、/L冰乙酸+2.47g/L硼酸],Ò液为0.2mol/L[10]作者简介:何为(1973-),男,博士生,主要从事制浆化学NaOH,配置方法见文献,再用酸度计校准其pH和生物化学研究.值.主要仪器为pHS-2C型酸度计,上海虹益仪器第12期何为等:一种改进的漆酶酶活检测方法47厂;UV-2201型紫外-可见分光光度计,日本中心的解离状态,从而升高或降低了漆酶酶活;漆酶SHIMADZU公司.A的最适pH图有2个峰,不常见,但有文献[12,13]1.3漆酶最适pH值的测定方法报道从蘑菇Agaricusbisporus和子囊菌类的在25e时,以2mLBritton-Robinson缓冲溶Monoc
7、illiumsaxena中分泌的漆酶稳定性曲线也有两液,外加1mL用蒸馏水稀释104倍的漆酶液为空白;个峰.先设定参数,使吸光度自动归零.取1mL相应pH值缓冲溶液中缓冲离子不同,漆酶所表现的活性水的Britton-Robinson缓冲溶液,用蒸馏水1mL稀释平也可能不同:漆酶酶活在以琥珀酸为缓冲液时较以4酒石酸钠的高[9].本实验所要调整的pH值范围广10倍的漆酶液,再加1mL的1mmol/LABTS溶液于
