环境因素对亚油酸异构酶的影响

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1、实验项目：异常环境因素对乳酸菌不同种间亚油酸异构酶影响的研究一、实验目的：本项目拟采用微生物细胞超声波处理、亚油酸异构酶蛋白的提取、凝胶过滤纯化、SDS-PAGE分析等实验技术，对正常环境条件下和异常环境条件下培养的乳酸菌细胞中的亚油酸异构酶进行研究，从而阐明环境因素对乳酸菌不同种间亚油酸异构酶酶活和酶分子的影响。实验有助于深入了解环境因素对细胞生物活性所造成的影响。二、实验原理1、微生物可以产生亚油酸异构酶，该酶具有专一性，可将亚油酸(LA)转化，得到较纯的、高活性共轭亚油酸(CLA)异构体-c9，t11及t10，c12-CLA。这两种异构体具有抗癌、抗粥状动脉硬化、

2、降低体内脂肪和固醇含量、抗氧化、促进生长、缓和免疫副反作用，所以研究乳酸菌亚油酸异构酶具有重大意义。2、本项目将研究环境因素(异常恶劣的物理和化学因素)对不同乳酸菌菌株亚油酸异构酶的影响。本实验首先分别对在正常条件下培养和异常环境条件下培养的各乳酸菌菌株采用超声波破壁，冷冻离心获粗酶液，测定其酶活力。该粗酶液经盐析、透析、SephadexG-100凝胶过滤层析纯化，再采用不连续SDS-聚丙烯酰铵(PAGE)检测不同环境条件下各菌株亚油酸异构酶的纯度、活力和测定分子量，进而分析异常环境因素对乳酸菌不同种间亚油酸异构酶的酶活和酶分子影响。3、亚油酸异构酶活测定，将该酶液作用

3、于亚油酸后，经正已烷萃取，用分光光度计测定233nm处的吸光值，再对照标准曲线求得共轭亚油酸的含量。一个亚油酸异构酶活力单位U定义为：1h内生成1μgCLA所需要的酶量定义为一个酶活力单位。K×G酶活力(U/ml)=————V×T式中，K为酶液稀释倍数；G为所生成的共轭亚油酸量(μg)；V为吸取酶液体积(测定时取0.2ml)；T为反应时间(h)。实验技术路线：1、乳酸菌在正常环境条件下培养测定亚油酸异构酶菌种活化→细胞正常环境条件下的培养→细胞收集→细胞破碎→硫酸铵分段盐析→透析→聚乙二醇(PEG)浓缩→SephadexG-100凝胶过滤层析→真空冷冻干燥→酶纯度鉴定及

4、分子量测定2、乳酸菌在异常环境条件下培养测定亚油酸异构酶菌种活化→细胞异常环境条件下的培养→细胞收集→细胞破碎→硫酸铵分段盐析→透析→聚乙二醇(PEG)浓缩→SephadexG-100凝胶过滤层析→真空冷冻干燥→酶纯度鉴定及分子量测定3、分析比对在两环境中各乳酸菌种间亚油酸异酶酶活和酶分子量的异同三、实验所需器材1、实验用菌株：1)植物乳杆菌（Lactobacellusplantarum)AS1.557培养温度300C2)嗜酸乳杆菌（Lactobacellusacidophilus)AS1.1854培养温度370C2、仪器设备电热恒温培养箱、厌氧培养箱、振荡培养箱、电子

5、天平、水浴锅、JY92-II超声波细胞破碎仪、Biofuge台式高速冷冻离心机、UV-2450紫外-可见光分光光度计、UV-1600紫外可见分光光度计、GL-20G高速冷冻离心机、BT1-100恒流泵、HD-21-88紫外检测器、SBS-100数控计滴自动部分收集器、DYY-11型电泳仪、DYCZ-24E型电泳槽、脱色摇床、真空冷冻干燥机四、实验安排实验人数：32人，安排5-6人/组，共6组。分任务分配植物乳杆菌组（正常环境条件组、异常物理条件组、异常化学条件组）；嗜酸乳杆菌组（正常环境条件组、异常物理条件组、异常化学条件组）实验总学时：80学时授课16学时：1、实验原

6、理介绍、教授学生查找资料、设计实验方案（8学时）2、讲授研究论文的写作方法、撰写论文（8学时）实验64学时：内容一、菌种活化、正常条件下的细胞培养以及异常条件下细胞的处理及培养（16学时）内容二、不同培养条件下各菌株亚油酸异构酶粗酶液的提取及酶活测定（16学时）内容三、不同培养条件下各菌株亚油酸异构酶的纯化及酶活测定（16学时）内容四、凝胶电泳鉴定分析不同菌种、不同环境条件下各细胞亚油酸异构酶分子量以及酶活力的测定（16学时）五、实验内容内容一、菌种活化、正常条件下的细胞培养以及异常条件下细胞的处理及培养实验步骤：冷冻菌种→12%脱脂奶活化培养→第二次12%脱脂奶活化培

7、养→转接至MRS液体培养基试管中→转接至MRS液体培养基三角烧瓶中→按2%接种量接入产酶培养液中→分别置于正常环境条件下和异常条件下进行产亚油酸异构酶的诱导培养。1、配制培养基种子培养基：用脱脂奶粉配成12%的脱脂乳培养基，分装在大试管内，每装10mL、115℃灭菌15min。（配制200mL）MRS固体培养基：酪蛋白胨1g、牛肉膏1g、酵母提取物0.5g、葡萄糖0.5g、乙酸钠0.5g、柠檬酸二铵0.2g、吐温801g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸镁0.02g、硫酸锰0.005g、碳酸钙2g、琼脂1.5g，蒸馏水100mL，加热搅拌均匀后，