ClonExpress MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书

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1、ClonExpressTMMultiSOneStepCloningKitVazymeBiotechCo.,Ltdwww.vazyme.com网站/Web:www.vazyme.comwww.vazyme.com咨询热线/Tel:400-600-9335Vazymebiotechco.,ltd.销售/Sales:sales@vazyme.com技术支持/Support:support@vazyme.com使用说明书技术服务/Service:service@vazyme.comVersion3.2目录Catalog1/产品概要C

2、lonExpressTM快速克隆技术ClonExpressTM技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15bp～20bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应30min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。

3、ClonExpressTMMultiS是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有专门针对多片段重组反应而优化的反应缓冲液和重组酶ExnaseTMMultiS。使用该试剂盒，可以一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆。此外，ExnaseTMMultiS还兼容常规酶切、PCR反应体系。克隆载体酶切产物或PCR产物以及插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。产品优点-简单、快速、高效-适用于向几乎任何载体的任何位点进行多片段拼接克隆-无需考虑插入片段自身携带的酶切位点-可一次实现多至五个插入片

4、段的顺序拼接克隆-线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆应用范围-多片段拼接克隆-全基因合成产品概要-DNA定点突变产品组成贮藏条件2/产品组成实验方案组分C113-01(10rxn)C113-02(25rxn)5×CEMultiSBuffer40μl100μl参考实例ExnaseTMMultiS20μl50μlpUC19controlvector,linearized(50ng/μl)5μl5μl注意事项ControlinsertMix5μl5μl常见问题与解决方案(0.5kb,10ng/μl;1kb,20ng/μ

5、l;2kb,40ng/μl)www.vazyme.com01/023/贮藏条件双酶切线性化：线性化完全，转化背景(假阳性克隆)低。推荐使用。本产品应置于-20℃储存。单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。4/实验方案注：ClonExpressTMMultiS重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克4.1实验流程概览（图一）隆(无插入片段)是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高

6、，应重新制备1).线性化克隆载体制备(参见4.2)；线性化克隆载体。2).插入片段扩增引物设计(参见4.3)；ClonExpressTMMultiS重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产3).插入片段PCR扩增(参见4.4)；物加热失活内切酶(参见内切酶使用说明书，例如HindIII，65℃孵育20min完全失活)4).进行重组反应(参见4.5)；后可直接用于重组反应。5).反应产物转化、涂板(参见4.6)；6).克隆鉴定(参见4.7)。B线性化克隆载体由反向PCR扩增制备我们推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩

7、增(PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase,Vazyme,P501)以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。CloneExpressTMMultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。克隆载体酶切产物或PCR扩增产物DNA纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(>

8、5kb)克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提高DNA纯度并去除一部分未线性化的环状载体(其电泳位置不同于线性化克隆载体)。不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。线性化载体制备方式模板类型快速实验方案最佳实验方案加热失活内切酶后酶切消化制备环状