实验八PCR产品纯化及定向克隆-09级

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1、实验八PCR产品纯化及定向克隆一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的DNA纯化和连接方法；巩固DNA酶切的操作。二、实验原理PCR产物一般都含有过量的引物、Taq酶及dNTP等成分，直接影响后续的基因操作，利用苯酚/氯仿、氯仿依次抽提反应体系中的酶，然后在酸性条件下用乙醇沉淀DNA。根据实验六所用的PCR引物，其产品的5′和3′末端分别具有EcoRI和NotI酶切位点，而载体pET32的多克隆位点中也有此两个酶切位点。因此，若将PCR产物与载体分别用EcoRI和NotI进行双酶切，所得的产

2、物相应末端正好互补，可用T4DNA连接酶在体外进行连接。正向引物（P1）EcoRI5’-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3’反向引物（P2）：NotI5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3’三、实验材料与主要试剂1、实验材料实验二提取的质粒载体pET32实验七的PCR产品以及实验八的RT-PCR产品2、主要试剂限制性核酸内切酶：EcoRI和NotIT4DNA连接酶苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿、醋酸钠（pH5.2）、无水乙醇、

3、70%乙醇等四、实验步骤1、PCR产品的纯化每组同学的PCR和RT-PCR产品合并，约130μl，转入1.5ml离心管中，向PCR产品中加入150μl苯酚/氯仿/异戊醇，旋涡混合，14000rpm离心5min；将上层水相转移至新离心管，加入150μl氯仿，旋涡混合，14000rpm离心5min；再将上层水相转移至新离心管，加10μl醋酸钠和250μl无水乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置30min；在4℃下14000rpm离心10min，去除上清，观察DNA沉淀。加20μl灭菌水溶解DNA，备用。四、

4、实验步骤2、PCR产品与载体pET32的双酶切分别在两个1.5mL离心管中准备双酶切反应混合液。A.10×Hbuffer5μlB.10×Hbuffer5μl0.1%BSA5μl0.1%BSA5μlEcoRⅠ2μlEcoRⅠ2μlNotⅠ2μlNotⅠ2μlPCR产品20μlpET32载体约2μg灭菌蒸馏水16μl加灭菌蒸馏水至总体积50μl将上述两个离心管内的混合物轻轻混匀，37℃水浴酶切3小时。四、实验步骤3、酶切产品的纯化酶切后的PCR产品和载体合并(约100μl)，加入100μl苯酚/氯仿/异

5、戊醇，旋涡混合，14000rpm离心5min；将上层水相转移至新离心管，加入100μl氯仿，旋涡混合，14000rpm离心5min；再将上层水相转移至新离心管，加10μl醋酸钠和250μl无水乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置30min；在4℃下14000rpm离心10min，去除上清；加入500μl70%乙醇洗涤DNA沉淀，在4℃下14000rpm离心5min，去除上清，空气干燥；加8μl灭菌水溶解DNA，备用。四、实验步骤4、目的基因(CaM5)与载体(pET32)的连接在灭菌的PCR管中依次加入

6、：10×T4DNALigasebuffer1μlT4DNALigase1μlPCR产品和pET328μl将混合物轻轻混匀，16℃连接过夜。第二天，从PCR仪中取出连接产物，置于-80℃保存到下次实验使用。五、实验结果本实验结果必须通过观察转化后所得菌落的多少来判断连接的效率。