汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理).docx

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1、HB-infusionTM无缝克隆试剂盒使用说明（附原理说明）一、产品简介HB-infusionTM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的GibsonAssemblyDNA定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。HB-infusionTM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25bp同源序列（图1，图3）。将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合，并加入HB-infusionTMMastermix，通过反应体系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接

2、酶的在50℃反应20min即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。图1.HB-infusionTM快速克隆试剂盒原理示意图。1.线性化目的载体（左上）；2.PCR获取目的片段。设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25bp的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3.按照一定比例把二者混合在HB-infusionTM的2´预混液内，50°C反应20min后直接转化E.coli即可。二、HB-infusionTM试剂盒的优点1.相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusionTM试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2.对酶切位点无要求，可

3、以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3.连接片段之间不会引入任何其他序列；4.可以同时克隆多个片段。三、产品包装产品组成使用次数体积2xHB-infusionTMMastermix20tests200mlPositivelinearizedpUCvector（250ng）5tests25mlPositivecontrolinsert(500ng)5tests25ml储存条件-20℃四、使用说明汉恒生物建议2-3个片段连接时，DNA片段的使用总量为0.02~0.5pmols，4~6片段连接时加入的DNA总量为0.2~1.0pmols。DNA拼接效率随着拼接片段的数量增加或者拼接片段

4、长度的增加逐渐降低。附：片段摩尔数量计算公式：pmols=片段质量(ng)´1000/(碱基对数´650daltons)（碱基数越多，pmols越少；质量越大，pmols越多），举例如下：线性化载体（~5000bp）50ng插入片段（~500bp）10~25ng注：50ng的5000bp（0.015pmols）的线性化dsDNA和10~25ng（0.03~0.075pmols）500bp的PCR产物体系（PCR产物和线性化载体的摩尔比=2：1~5：1）。五、操作步骤1.制备线性化载体和插入片段1.1.载体制备---线性化处理A.质粒酶切法在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双

5、酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。注：1.为了降低载体自连背景，提高阳性率，建议采用双酶切载体质粒。酶切最好能切出一个较大片段，这样回收的目的条带可以和没有切开的质粒明显分开。2.质粒单酶切容易造成载体切割不完全和自连，导致假阳性的产生。因此，必须单酶切的时候建议延长酶切时间并脱磷处理（酶切2h-过夜，CIP处理20min），同时做好空载的对照。3.请务必跑胶回收线性化的载体，否则非线性化质粒会带来极高的背景。4.一种特殊情况：如果采用双酶切彻底线性化载体，而插入片段又没有双酶切的识别位点，也可以跳过纯化步骤，只需热失活内切酶即可用于下一步拼接反应。B.质粒PCR法图2.PCR法线

6、性化载体示意图。在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段。选取合适的位点，设计正向和反向引物直接进行载体质粒的PCR扩增，一般载体长度均大于3kb，建议采用高保真的DNA聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议对PCR扩增后的线性化载体进行割胶纯化，去除环状模板质粒，提高阳性率。1.2.目的插入片段制备设计引物进行目的片段PCR扩增，引物设计要保证目的片段两端有15~25bp序列与线性化载体的两端一致（重叠序列的Tm³48°C，可以简单假设A-T碱基对=2°C，G-C碱基对=4°C）便于拼接反应的进行。PCR引物包括5’端与

7、载体同源的15~25bp以及目的片段特异性序列20~25bp（见下图3）。PCR产物经跑胶纯化待用。图3.采用HB-infiusionTM试剂盒时PCR上下游引物设计示例。针对双酶切法线性化载体设计插入片段的PCR引物，其重叠区域为15~25bp+酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。如果是PCR法线性化载体，扩增插入片段的PCR引物5’端直接设计成与线性化载体末端15~25bp重叠即可。2.冰上融化并且充分混匀HB-infusionTMMaster