耳蜗毛细胞氧化损伤microRNA与mRNA表达谱

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1、南方医科大学2007级博士学位论文耳蜗毛细胞氧化损伤microRNA与mRNA表达谱及其调控网络研究IntegratingmicroRNAandmRNAexpressionprofilesofcochleahaircellsresponsetooxidativestresstoidentifyregulatorynetworks课题来源：国家自然科学基金项目(30971193)广东省自然科学基金项目(7018635)广州市医药卫生科技重点项目(2009-ZDi-07)广州市医药卫生科技重点项目(2006-ZDi-06)专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员劳动卫

2、生与环境卫生学王致邹飞教授蒋义国教授刘移民主任医师董军教授余日安教授毛丽梅教授论文评阅人邹剑明主任医师杨爱初主任医师张维森主任医师2010年5月26日广州卜f舢删Ⅲ㈣7删埘删埘M册删}Y1770457博士学位论文耳蜗毛细胞氧化损伤microRNA与mRNA表达谱及其调控网络研究博士研究生：王致指导教师：邹飞教授摘要背景氧化损伤和活性氧(也称氧自由基，ReactiveOxygenSpecies，ROS)与药物性耳聋、噪声性耳聋、以及老龄性耳聋密切相关。顺铂、氨基糖甙类药物和持续的噪声均可使耳蜗毛细胞产生高浓度的ROS而导致毛细胞损伤。此外，抗氧化剂有助于耳蜗毛细胞的存活及维持其正

3、常功能。已有研究表明ROS可以调节基因转录水平的表达，庆大霉素和顺铂可通过产生高浓度的ROS而调节耳蜗毛细胞中基因的转录，以及氧化损伤相关的信号转导通路。然而，转录后调控在基因表达和细胞存活中起着重要的作用，仅有研究发现在心肌细胞和血管平滑肌细胞中ROS可以通过转录后调控影响基因的表达，但未见有关耳蜗毛细胞氧化损伤相关的基因转录后调控方面的报道。因此，探寻ROS对耳蜗毛细胞基因转录后的调控及其调控机制，对于阐明耳蜗毛细胞氧化损伤的机制具有重要意义。MieroRNAs(miRNAs)是一种内源的、非编码的小RNA，可通过对靶基因mRNAs的降解作用和翻译抑制作用而负向调控基因的表

4、达。一种miRNA可调控多个靶基因，而若干miRNAs也可协同作用于一个靶基因，从而调控细胞的分化、增殖／生长、迁移和凋亡。MiRNAs在小鼠内耳感觉上皮的发育和成熟过程中具有重要作用，也是听力损失的重要调控因素。最近的研究显示miRNA异常可能是人类和小鼠进行性听力损失的病因。然而未见有关耳蜗毛细胞氧化损伤相关的miRNA表达及其在基因调控方面的报道。因此，研究耳蜗毛细胞中文摘要氧化损伤和高浓度ROS对miRNAs表达的影响，以及miRNAs在ROS介导的基因调控中的作用及其生物功能，将对深入了解耳蜗毛细胞损伤和听力损失的机制具有重要意义。研究目的(1)利用有机氧化剂叔丁基过

5、氧化氢(tert-ButylHydroperoxide，t-sI-W)染毒耳蜗毛细胞(HouseEarInstitue-OrganofCorti1，HEI．OC1)，通过检测t-BHP对细胞增殖、细胞凋亡和ROS产生的影响，建立耳蜗毛细胞氧化损伤模型；(2)通过miRNA表达芯片和全基因组mRNA表达芯片检测，研究耳蜗毛细胞氧化损伤miRNA和mRNA表达谱；(3)通过生物信息学分析耳蜗毛细胞氧化损伤差异表达miRNA与mRNA，研究耳蜗毛细胞氧化损伤miRNA与mRNA表达调控网络及其生物功能，为耳蜗毛细胞氧化损伤的基因表达及其转录后调节提供更直接的科学线索。研究方法(1)细

6、胞增殖检测HEI-OCl细胞经t-BHP(0Ⅲ、25州、50州、100ttM、2000M、400州)染毒12h，以及1001uMt-BHP染毒oh、3h、6h、12h、24h、48h后，分别用CellCountingKit-8(CCK-8)检测不同浓度和不同时间t-BHP染毒后细胞增殖能力的改变。(2)细胞凋亡检测HEI—OCI细胞经t-BHP(0州、25vM、50vM、100州、200州、400vM)染毒12h，用膜联蛋白V(AnnexinV)与碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)双标记后，通过流式细胞术检测不同浓度t-BHP染毒对HEI．OCI细胞凋亡的影响。(

7、3)胞内ROS检测设置0州、25rtM、50州、100Ⅲ、200rtM、400小6个浓度t-BHP染毒HEI．OCl细胞组，经DCFH．DA探针标记后，通过荧光倒置显微镜观察胞内ROS生成情况，并用流式细胞术定量检测胞内ROS水平。(4)microRNA芯片检测HEI-OCl细胞经0rtM、50州、100州、200州Ⅱ博士学位论文t-BHP染毒12h后，利用ExiqonLNA探针标记细胞总RNA，经浓缩、杂交、图像扫描后，分析耳蜗毛细胞氧化损伤miRNA表达谱。($全基因组表达谱芯片检测HE