细胞凋亡的形态学检测1

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1、荧光显微镜下检测细胞凋亡作者：2010级生物技术许春燕摘要：细胞凋亡是生命科学目前的一个研究热点．检测细胞凋亡的方法和技术取得了很大的进步．从早期细胞内某些基因转录表达的变化、代谢生理的变化，到晚期细胞形态的确诊、细胞内代谢物质的转变，从定性、定量到原位定性定量等，都发展了相对成熟的检测技术．相比于其他检测方法，荧光染色法检测细胞凋亡具有经济、快速、敏感等特点。关键词：细胞凋亡荧光显微镜观察法正文：下面是荧光显微镜下检测细胞凋亡的四种方法：1、吖啶橙染色法用吖啶橙溴化乙锭混合染色法。吖啶橙对DNA有特异的亲和力。结果判定。荧光显微镜下，可见到活细

2、胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色荧光，胞质呈橘黄色或者橘红色荧光，出现凋亡细胞时，核染色质的黄绿色荧光浓聚在核膜内侧，凋亡细胞核的特征性形态可被清晰地辨认。坏死细胞的细胞质内黄绿色或者橘黄色荧光减弱，有的甚至消失。具体方法如下：（1）．制备活细胞悬液，浓度约为107/ml。（2）．取95μl的细胞悬液，加5μl的吖啶橙贮存液混匀。（3）．吸一滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片。（4）．荧光显微镜选用激发滤片BG12或BV等，阻断滤片用515nm或。对体外培养的活细胞经荧光素处理后，可在荧光显微镜下直接观察细胞形态的改变．结果；用吖啶橙染色后正常细

3、胞核DNA呈黄色或黄绿色的均匀荧光，细胞质和核仁的RNA呈桔黄或桔红色荧光；凋亡细胞的细胞核或细胞质内有致密浓染的黄绿色荧光，甚至有黄绿色碎片；坏死细胞的细胞质内的荧光较弱或无。2、Hoechst33258染色法Hoechst33258能够穿过完整的细胞膜，所以可以用来染活细胞，在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。具体方法如下：（1）．原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。（2）．细胞固定液4℃固定5min。（3）．蒸馏水稍洗后，点加Hoechst33

4、258染色液，10min。（4）．蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。（5）．封片剂封片后荧光显微镜观察。结果：用Hoechst33258染色后活细胞核呈弥散均匀的荧光，凋亡细胞内可见浓染致密的颗粒状荧光或块状荧光．该方法方便易行，应用较多，但定量和定性方面较差。故在实际应用中极少被单独使用。3、Hoechst33342染色法Hoechst33342能够穿过完整的细胞膜，所以可以用来染活细胞，在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。具体方法如下：(1）．将Hoechst3

5、3342加入培养的细胞中，终浓度为10μg/ml37℃孵育30min。(2)．4％的多聚甲醛和培养液以1：3混合，使多聚甲醛的浓度为1％，固定细胞5～10min。(3)．固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。(4)．荧光显微镜激发滤片选用UV激发滤片，阻断滤片为400～500nm。以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色：具体方法如下：(1)．收集（0.5～3.0）&time106个细胞，500～1000r/min，离心5min去上清。(2)．洗1次，500～1000r/min，离心5min去。(3)．用3％多聚甲醛50μl重悬细

6、胞，室温下固定10min。(4)．洗1次，500～1000r/min离心5min去。(5)．用15μl的Hoechst33258或33342重悬细胞，终浓度为16μg/ml，孵育15min。(6)．取10μl放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数500个细胞，计算调亡率。4.DAPI法DAPI与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部

7、分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。展望：尽管目前已经有不少方法可以检测细胞的凋亡，象透射电镜、荧光显微镜及流式细胞仪等可大致检测出细胞凋亡的早、中、晚期，而且能区分凋亡细胞和坏死细胞；PI染色后用流式细胞仪检测可对大量标本进行检测，Hoechest结合PI染色区分凋亡细胞和坏死细胞，AnnexinV联合PI检测膜完整性等都是较为理想的方法；尤其是TUNEL法既确定细胞凋亡，又显示细胞表面抗原，定性定量的检测更具优势。结论：荧光染色法检测细胞凋亡具有经济、快速、敏感等特点。荧光染色法检

8、测的细胞凋亡率大于流式细胞仪方法的检测值是因为荧光染色法能把不同时期的细胞凋亡都显示出，特别是早期凋亡细胞。不足之处是：显