子学习情境3干扰素发酵

《子学习情境3干扰素发酵》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、子学习情境3干扰素发酵基因工程菌的发酵生产水平，不但和菌种的遗传特性有关，而且和发酵工艺控制有密切关系。基因工程药物实现工业化生产需要解决两个关键问题，一是如何构建基因工程菌使其含有外源药物基因，并且能够有效合成目标蛋白；另一个是如何实现基因工程菌的发酵工艺控制，实现目标产物的高效表达。基因工程菌株PseudomonasputidaVG84[pVG3]工程菌株应该具备假单胞杆菌宿主细胞的特征和生产于扰素的能力。基因工程菌的特性如下：1、宿主细胞假单胞杆菌特性(1)细胞形态。革兰阴性，可运动，有荚膜，无芽抱，杆状，长度为3～5

2、µm。(2)菌落特征。在LB琼脂培养基上，30℃培养24h，其菌落直径为2.5～3.Omm，灰绿色半透明状。菌落之间结构相同，具有黏稠性。2、生化特性不能将明胶、淀粉、聚-β-羟丁酸液化为可溶性单糖，不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。菌株为苏氨酸营养缺陷型，可以利用L-缬氨酸、DL-精氨酸和L-苏氨酸作为碳源。3、遗传特性DNA中G和C的含量为63%。细胞中携带pVG3质粒，具有硫酸链霉素、盐酸四环素和氨卡青霉素的抗性。4、生产能力具有生产干扰素-a2b的能力，其放射性免疫学效价不低于2.O×lO9IU/L。

3、任务1菌种库和工作菌种库的建立及保存1、菌种库的建立、传代及保存从原始菌种库出发，传代、扩增后，冻干保存，作为主代菌种库(Mastercellbank,MCB)，主代菌种库不得进行选育工作。从主代菌种库传代、扩增后，甘油管保存，作为工作菌种库(Workingcellbank,WCB)。工作种子库也可由上一代工作种子库传出，但每次只限传三代。每批主代菌种库均进行划线LB琼脂平板、涂片革兰氏染色、对抗生素的抗性、电镜检查、生化反应、干扰素的表达量、表达的干扰素型别、质粒检查的检定，合格后方可投产。原始菌种库、主菌种库和工作菌种库

4、于-70它以下温度保存。2、工作菌种库的建立及保存(1)培养基制备。生产过程中使用的培养基均按一定工艺要求配制。(2)接种、转移及培养。取12支主代菌种库菌种接大摇瓶内，摇床培养，至吸光值(OD值)为5.5±1.0。将己培养好的摇瓶种子液转移至种子罐中，通人无菌空气，培养至吸光值符合放罐要求(OD值为8.0±2.0)。种子罐培养结束后，无菌操作转移到离心管中，离心l5mmn，加新鲜菌种培养基，将菌体制成菌悬液，并加入甘油使其浓度达到18%，分装于Ependorf管中，每支(1.0±0.2)mL。(3)保存。分装完毕，于-2O

5、℃放置16～20h，在-70℃下可保存3年。任务2干扰素发酵工艺过程控制一、干扰素发酵工艺过程(1)菌种制备取-7O℃下保存的甘油管菌种(工作种子批)，于室温下融化。然后，接人摇瓶，培养温度30℃，pH值7.0，250r/min活化培养(18士2)h后。进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。(2)种子罐培养将己活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量为10%，培养温度30℃，pH值7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4h，当OD值达到4.0以上时，转人到发酵罐中，进行二级放大培养，同时取样进行显微

6、镜检查和LB培养基划线检查，控制杂茵。（3)发酵罐培养。将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH值7.0。级联调节通气量和搅拌转速。控制溶解氧为30%，培养4h。然后控制培养温度20℃，pH值6.0，溶解氧为60%，继续培养5～6.5h。同时进行发酵液杂菌检查。当OD值达9.0士1.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转人收集罐中，加人冰块使温度迅速降至10℃以下。(4)菌体收集。将己降温至2O℃以下的发酵液转人连续流离心机，1600Or/min离心收集。进行干

7、扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于-20℃冰柜中保存时。不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。整个发酵工艺过程如图4-1所示。发酵液降温生产菌种菌体收集配制培养基原料离心菌体冷冻保存接种发酵罐培养菌种活化蒸汽灭菌种子罐培养蒸汽灭菌蒸汽灭菌图3-1干扰素-a2b发酵工艺流程图二、干扰素发酵工艺过程控制(1)发酵中菌体生长与干扰素合成的关系在假单胞杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5h分裂速度最快，到3.5h开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5h之后，在4h达到最大，然

8、后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单胞杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态。(2)培养基组成。一般地，种子培养基的营养成分宜丰富些，尤其是氮源的含量应较高(即C/N低)。相反，对于发酵培养基，氮源含量应比种子培养基稍低(即C/N高)。假单胞杆菌在以水解酪蛋白、酵母粉等营养