学习情境一细菌发酵制药

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1、学习情境一细菌发酵制药发酵制药子学习情境1.1天冬酰胺酶发酵天冬酰胺酶生产的工艺流程任务1菌种保藏任务2菌种复壮任务3种子扩大培养任务4发酵罐的使用和维护任务5发酵控制、分离纯化及活性测定子学习情境1天冬酰胺酶发酵任务1菌种保藏一、菌种保藏的目的保持菌种的存活率与优良遗传性状；防止菌种退化与污染使已经退化的菌种恢复原有的性状总之，就是防止优良遗传性状的丧失和菌种死亡。二、菌种保藏的原理挑选典型培养物（typicalculture）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。菌种的保

2、藏主要是依据微生物的生理、生化特性，人工创造条件使微生物代谢活动处于不活泼状态。利用微生物的孢子、芽孢及营养体，给以不适合其萌发、生长、繁殖的条件，即低温、干燥、缺氧、缺营养等手段来达到菌种保藏的目的。三、菌种的保藏方法斜面保藏法沙土保藏法冷冻真空干燥保藏法试管熔封保藏法矿油保存法（一）斜面保藏法1、贴标签：将注有菌株名称和接种日期的标签贴在试管斜面正上方。2、接种：将待藏菌种用些面接种法移种至标明菌名的相应试管斜面上。3、培养：细菌置37℃恒温培养15～24h，酵母菌置28～30℃恒温培养36～60h，放线菌和丝状真菌置28℃培养

3、4～7d。4、收藏：为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎或用熔化的固体石蜡熔封棉塞后置4℃冰箱保存。保存温度不宜太低，否则会因结冰脱水而加速菌种的死亡。斜面菌种（二）沙土管或硅胶管保藏法1、处理沙土：取河沙经60目筛子过筛以除去大的颗粒，用10%HCL浸泡（用量以浸没沙面为度）2～4h（或煮沸30min）以除去有机质，然后倒去盐酸，用流水冲洗至中性，烘干或晒干备用。另取非耕作层瘦黄土（不含有机质）风干、粉碎，用100～120目的筛子过筛备用。2、装沙土管：将沙与土按2：1或4：1（W/W）比例混合均匀，装入试管（10mm×1

4、00mm）中，装置约1cm高，加棉塞后用高压蒸汽灭菌（121℃灭菌30min）。灭菌后取少许置于牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在合适的温度下培养一段时间确证无菌生长才能使用。3、制备菌液：吸3ml无菌水至斜面菌种管内，用接种环轻轻搅动，洗一下孢子制成孢子悬液。4、加孢子液：吸取上述孢子液0.1～0.5ml于每一沙土管中，加入量以湿润沙土达2/3高度为宜。5、干燥：将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P2O5（或变色硅胶）做干燥剂，再用真空泵抽气2～4h以加速干燥。6、收藏：沙土管可选择下列方法之一。⑴保藏于干燥器中。⑵将沙

5、土管取出，管口用火焰熔封后保藏。⑶将沙土管装入含CaCl2等干燥剂的大试管内，塞上橡皮塞并用蜡封管口，置于4℃冰箱中保藏。7、恢复培养：使用时挑少量混有孢子的沙土接种于斜面培养基上即可。沙土管仍可原法继续保藏。（三）冷冻真空干燥保藏法分支管再与麦氏真空计和冷凝管相连。冷凝管的另一端连接在真空泵上。置冷凝管于盛有干冰（固体CO2）的广口保温瓶中，使安瓿管中抽出的水汽进入冷凝管内立刻冻结。将安瓿管的下半部也埋入干冰中，使管内物质骤然冷却。约10min，管内物质已全部冻结，开动真空泵30min后，将安瓿管移入-15℃的冰盐水中，继续开动真

6、空泵抽气1h，然后将安瓿管置于室温中，再抽气30min。此时管内物质已全部干燥，样品呈疏松状。用微型煤气灯在真空状态下，熔封安瓿管的颈部。将制好的冷冻菌种管置于4℃冰箱中保藏。先将牛奶煮沸后冷却，去掉上面的一层脂肪。反复三次后用脱脂棉过滤，或者将牛奶在3000r/min的离心机中离心数分钟，除去表面脂肪后，在50kPa压力下灭菌30min。然后用牛奶洗下在斜面上长好的菌体，制成菌悬液，装入安瓿管中约0.1ml，塞上棉塞，用橡皮管将安瓿管连接在分支管上（见图1-1）图1-1冷冻干燥封管装置简图1、安瓿管2、干冰容器3、接真空计4、接真

7、空泵5、冷凝管（四）试管熔封（密封）保藏法试管熔封法的一般操作如下：用各种琼脂斜面（普通肉汤等）常规灭菌后，经接种，室温培养24～48小时后，将接种菌生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封，分别置室温和冰箱下保存。使用时，用砂轮在管口划一圈，并在乙醇灯下火焰灭菌后敲开管口即可转接到另一斜面上，由于试管经熔封后，可防止培养基水分蒸发，又可减缓细菌的代谢速度，并能防止杂菌污染。密封法保藏法将需保藏菌种按无菌操作要求接种至固体培养基（细菌采用肉汤琼脂、酵母采用蔡氏培养基、放线菌采用高氏１号培养基）上，经适温培养后，（细菌１～２d，孢芽菌、放线菌

8、５～７d，酵母菌３d）塞紧棉花塞，放在干燥器内，干燥器密封处涂上凡士林。盖紧后使之与真空泵相连接，开动真空泵抽真空30rain至１h（此时真空度约为640），关闭密封口，拔出胶塞，置于室温下保存，待使用时，打开盖，取出菌种，接种至培养