Multipoints Mutagenesis Kit

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1、TaKaRaCode：D407MultipointsMutagenesisKit(20次量)目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存1●本Kit以外必备试剂和仪器2●引物设计说明2●试剂盒原理3●使用ControlPlasmid时的实验例3●多位点定点突变实验操作方法7●实验例10●Q&A10●参考文献10●制品说明本试剂盒是利用一对设计特殊的锚定引物（AnchorPrimer）及几条定点突变引物对DNA多个不同位点同时进行定点突变的试剂盒。锚定引物“尾巴”上的特异性序列是与大多数基因都不相匹配的，因此保证了PCR扩增的特异性。本试剂盒的主要原理是：设计合成同一方向的锚定引物及定点突变引物，

2、将锚定引物及定点突变引物用T4PolynucleotideKinase磷酸化后与模板质粒DNA进行退火，再使用T4DNAPolymerase和T4DNALigase进行延伸和连接形成突变单链，然后使用锚定引物“尾巴”上的特异性引物（ETailF/ETailR）和高保真DNA聚合酶PrimeSTAR对突变单链进行PCR扩增，再将获得的双链PCR产物克隆回原载体中，即可达到实验目的，获得目的突变体。本试剂盒操作快速简单，只需一天时间便可以完成整个突变操作。本试剂盒尤其适用于插入片段长度在1.0kbp以下的多位点基因突变实验，对于1.0kbp以上的DNA片段的多位点基因突变，由于引物退火的不完全、P

3、CR扩增中可能引入新的突变点等原因，可能降低实验成功率。本公司曾经使用本试剂盒，成功进行了1.5kbpDNA片段的多位点基因突变实验。本试剂盒中的AnchorF1和AnchorR1引物可供克隆于pUC系列载体或pBluescript系列载体中的DNA片段的多位点基因突变实验，使用方便。使用试剂盒中的ControlPlasmid及各种Control实验用引物可进行Control实验。●制品内容（20次量）T4PolynucleotideKinase（10U/μl）40μl10×ReactionBuffer*140μlATP（10mM）48μl10×AnnealingBuffer40μl10×Ex

4、tensionBuffer60μlT4DNALigase（60U/μl）20μlT4DNAPolymerase（1U/μl）20μlTMPrimeSTARHSDNAPolymerase（2.5U/μl）10μlTM2+5×PrimeSTARBuffer（Mgplus）200μldNTPMixture（2.5mMeach）80μlControlPlasmid（50fmol/μl）20μlControlPrimerMix（12.5pmol/μleach）20μlControlAnchorF（8pmol/μl）5μlAnchorF1（8pmol/μl）*220μlAnchorR1（8pmol/μl）

5、*225μlETailF（10pmol/μl）25μlETailR（10pmol/μl）25μlLigationSolutionI100μl*110×ReactionBuffer于-20℃保存时会有白色浑浊出现，溶解后不影响反应。*2AnchorF1与AnchorR1是基于pUC系列载体、pBluescript系列载体设计的锚定引物。AnchorF1的3’端和AnchorR1的5’端与上述系列载体的多克隆位点两侧序列完全一致；AnchorF1的5’端与ETailF序列完全相同，AnchorR1的3’端与ETailR序列完全互补。当要突变的DNA片段克隆于上述系列载体中时，锚定引物可以直接使用A

6、nchorF1和AnchorR1。●保存:-20℃-1-●本Kit以外必备试剂和仪器·PCR扩增仪。·水浴锅。·小型离心机。·各种移液枪。·各种型号的Microtube、Tip等。·AgaroseGelDNAPurificationKitVer2.0（TaKaRaCode:DV805A）。·DNAFragmentPurificationKitVer2.0（TaKaRaCode:DV807A）。·NdeI、HindⅢ（用于Control实验）。·JM109CompetentCell·灭菌蒸馏水。●引物设计说明1.Kit中的AnchorF1与AnchorR1是基于pUC系列载体、pBluescri

7、pt系列载体设计的锚定引物。当要突变的DNA片段克隆于上述系列载体中时，锚定引物可以直接使用AnchorF1和AnchorR1。2.当要突变的DNA片段克隆于其他载体中时，则需要设计锚定引物。上游锚定引物AnchorF的3’端和下游锚定引物AnchorR的5’端应与载体序列完全一致；AnchorF的5’端应与ETailF序列完全相同（见下述【各种引物序列】表中AnchorF1的阴影部分），Anch