植物衰老相关基因的克隆与分析

《植物衰老相关基因的克隆与分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、电子科技大学博士学位论文植物衰老相关基因的克隆与分析姓名：周建平申请学位级别：博士专业：生物医学工程（生物技术）指导教师：任正隆20070613摘要植物衰老是一个受基因高度调控的主动的、有序的过程。尽管已成功地从不同物种中分离、克隆出许多与衰老相关的基因，并对其表达、调控进行了初步研究，但是对调控衰老这一过程的机制仍然知之甚少，所以对新的与衰老相关基因的分离研究就显得十分重要。本论文分别从小麦和手掌参中分离出了蛋白翻译起始因子基因5A(eIF5A)和与叶片衰老相关基因(GcB5)，并对它们进行了深入的研究，所得结果为研究衰老相关基因，植物衰老机理提供重要信息，同时所得细菌的

2、蛋白质组数据为生物工程菌操作提供了重要实验依据。本论文主要结果如下：1．利用5’，3’RACE技术，首次克隆了小麦eIF5A基因的全长cDNA序列(TaeIF5A—1)。并从基因组DNA中克隆得至lJeIF5A基因的两个DNA序列(TaeIF5A_2和TaeIF5A一3)。另外，还从其它9个小麦族物种中克隆了9个eIP5A基因的部分序列。2．根据eIF5A的蛋白序列，对植物eIF5A基因进行了进化分析，结果表明小麦eIF5A基因在植物eIF5A基因家族中代表较为古老的类型。根据10个小麦族物种的eIF5A基因的第二内含子序列，对小麦族物种的eIF5A基因进行了进化分析，结果

3、表明该基因与物种进化同步，说明可以用该基因的第二内含子序列对所有小麦族物种进化关系进行评价。3．利用小麦中国春端体系和Langdon--体代换系将TaeIF5A-2定位于小麦染色体2BL上。根据TaeIF5A—l在线(http：／／wheat．pw．usda．gov／wEST／blast)比对结果，推测TaeIF5A-2位于染色体2AL，2DL和7BL。4．利用半定量RT—PCR方法研究了小麦eIF5A基因在不同组织中的转录水平，结果显示了eIF5A基因在剑叶中的表达下调，在根中表达量最低。表明TaeIF5A一1的表达具有时空特异性，同时说明TaeIF5A一1与叶片发育进程

4、(衰老)密切相关。5．eIF5A基因的组织结构分析显示TaeIF5A一2和TaeIF5A一3均由6个外显子和5个内含子组成，起始密码子(ATG)和终止密码子(T从)分别位于第二和第六外显子内。TaeIF5A-2和TaeIF5A一3的相似性为82．3％，都形成636bp的转录产物，均编码161个氨基酸的蛋白质，它们与TaeIF5A-1仅有6个碱基的差异。其中除两者的内含子2相似性为59％外，其他所有相应内含子的相似度均大于80％，两者所有的相应外显子的相似度均大于97％。6．根据TaeIF5A一1序列，成功构建了eIFSA基因的原核表达载体pET28a：eIF5A。原摘要核表

5、达结果表明eIF5A能够体外高效表达，进一步Westernblot分析表明所表达的约18kD特异蛋白确为小麦eIF5A蛋白。7．利用改进的Oligo—capping方法，成功构建了名贵中药手掌参(GymanadeniaConopseaR．Br．)的全长eDNA文库。经综合评价，文库的库容量达到了8×105个／ugcDNA，全长cDNA比例达至U80％，重组率超过96％。该文库的建成为筛选衰老相关基因提供了研究平台。8．利用衰老相关基因的简并引物，从cDNA文库中得到目的克隆GcB5(DQ407755)，GcB5序列长度为1810bp，5’端非编码区为169bp，3’端非编码

6、区为216bp，编码区为1422bp，编码474个氨基酸、理论分子量为53kDa的蛋白。序列比对显示GcB5与拟南芥叶片衰老相关基因皿S7(基因登录号：AB047810)在核苷酸、蛋白质水平上的相似程度分别达到51．9％和56．55％。充分表明GcB5是与叶片衰老相关基因。9．本文构建了原核表达载体pET28a：GcB5，表达结果显示没有可见的表达蛋白；LB平板生长实验和细胞数量变化的监测实验表明表达GcB5可以抑制细菌生长和繁殖。10．本文运用蛋白质组学的方法研究了在GcB5诱导表达下的EcoliBL21蛋白质组变化情况，筛选出91个与细菌生长抑制相关的不同蛋白质。其中，

7、55个蛋白质与代谢和生物合成有关，3个蛋白与抗毒素相关和其它12个与细菌生长抑制的重点蛋白。表明表达重组蛋白GcB5会导致严重的胁迫反应，从而全面影响细菌的生长。11．利用半定量RT—PCR来研究大肠杆菌grpE，ompA，oxyR，mreB，pspA，cysK，ompFclpX，hslU，pnp，ftsZ，minD，ahpC，yeaD，tolCanddacA等16个基因在GcB5诱导下的RNA转录表达水平，结果表明诱导表达GoB5基因显著影响大肠杆菌基因的转录水平。与对照(转化pET28a(+)的大肠杆菌)相比，