植物 tag 合成途径相关基因的克隆与分析

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1、植物TAG合成途径相关基因的克隆与分析植物种子中的油脂主要以三酰甘油（TAG）的形式储存，TAG形式的产品在食品、保健品和工业产品方面都具有较大的经济价值（王镜岩，2000）。为了对含油量相关基因的功能进行深入分析，本研究克隆或合成了催化整个三酰甘油合成途径的含油量相关基因。利用同源序列法从油菜中克隆含油量相关基因DGAT的全长cDNA序列，对它们的序列特征进行了生物信息学分析.2.1材料与方法2.1.1材料2.1.1.1供试植物材料甘蓝型油菜（BrassicanapusL）中双9号（ZS9）基因组D

2、NA用于本研究目的基因的分离，种子由本实验室保存。2.1.1.2菌株与质粒大肠杆菌（Escherichiacoli.）克隆菌株Top10，购自Invitrogen公司；克隆目标基因载体pAmp由本实验室吴刚博士构建，商业化植物转化载体pBI121（Kanr）购自ToYoBo公司。2.1.1.3酶与生化试剂ReverTraAce-α-TM试剂盒、高保真DNA聚合酶（KodPlus）购自ToYoBo公司；1kbDNALadderMarker、TaqDNA聚合酶购自Fermentas公司；Trizol购自I

3、nvitrogen公司;T4DNA连接酶购自NEB生物公司；限制性内切酶其它工具酶皆购自宝生物工程（大连）有限公司和NEB公司；PCR纯化试剂盒购自百泰克生物技术有限公司，质粒小量提取试剂盒购自北京索来宝科技有限公司；LB培养基成分，Car、Kan、Rif、Str等抗生素购自国内相关厂商；PCR引物合成由上海生工生物技术公司完成。测序由华大基因研究院武汉测序中心进行。2.1.1.4仪器与设备上海福玛实验设备有限公司恒温培养箱；GRANT－000751制冰机；eppendorfcentrifuge－54

4、15、5424离心机；上海福玛实验设备有限公司三孔恒温水浴锅；中国科学院武汉科技仪器厂HQ452恒温摇床；FisherscienticficIsotemp3016连接仪；Millipore纯水仪；eppendorfcentrifuge－5417冷冻离心机；BIO-RAD双模块PCR仪；美的微波炉一台；BIO-RAD电泳仪；BIO-RAD凝胶成像系统；eppendorf各种规格移液枪一套。2.1.2方法2.1.2.1油菜叶片组织RNA的提取与RNA的反转录a)称取100mg油菜叶片置于研钵中，加液氮迅速

5、用力将叶片碾成粉末，收集粉末至液氮预冻的2.0mlEP管；b)向管中加入1ml的Trizol和50μl的β-巯基乙醇，盖紧EP管后迅速用力摇晃，直到粉末充分混入试剂；c)加200μl氯仿，同样用力混匀，室温静置数分钟；d)12000rpm，4℃离心15min；e)取上清,加等体积的氯仿，混匀；f)12000rpm，4℃离心5min；g)取上清,加等体积的异丙醇，混匀，于室温静置数分钟；h)12000rpm，4℃离心15min，RNA即以胶状沉淀形式附着于管底；i)加1ml70%的乙醇洗涤沉淀；j)12

6、000rpm离心5min，弃上清。移液枪吸走剩余液体，置超净台上数分钟使乙醇挥发；k)加50μlDEPC水并吹打沉淀使其溶解。检测，琼脂凝胶电泳第一链cDNA的合成采用ReverTraAce-α-TM试剂盒完成，使用Oligo(dT)20和随机引物进行反转录反应，体系如下：1×ReverTrabuffer2μldNTP1μlOligo(dT)201μlRandomprimer1URNaseinhibitor1UReverTraAce2μl总RNADEPC处理过的水补充体积至20μl反应程序为30℃5m

7、in，42℃30min，99℃5min。反应所得cDNA稀释20倍后分装，即可用于PCR扩增。2.1.2.2克隆基因所使用的引物PCR扩增克隆基因引物根据GenBank中的相应基因的mRNA序列从非编码区与编码区相连处分别设计表引物：2.1.2.3克隆基因的PCR反应体系及条件目的基因扩增PCR反应体系包括1μL模板cDNA，5μL10×buffer，4.5μL25mmol/LMgSO4，4.5μL2mmol/LdNTP，0.5μL10μmol/L正向引物，0.5μL10μmol/LP2反向引物，1.

8、0μL1U/μL高保真KodPlusDNA聚合酶，补ddH2O至50μL。PCR反应条件为94℃预变性3min，然后94℃30s，58℃30s，68℃1.5min，25个循环，最后68℃延伸5min，4℃保存。采用Bio-Rad双头PCR仪完成反应，产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。2.1.2.4目的基因的克隆pAmp质粒用EcoRV单酶切，酶切体系为1μL模板，5μL10×Buffe（r4），1μLBSA，1μLEcoRV，补ddH2O至50μL，37