N型乙酰胆碱受体α10亚基在大鼠内耳耳蜗、前庭中的表达

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1、http://www.paper.edu.cnN型乙酰胆碱受体α10亚基在大鼠内耳耳蜗、前庭中1的表达111姚琦，孔维佳，程华茂华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科（430022）Email:meniere@163.com摘要：目的：研究N型乙酰胆碱受体α10亚基在大鼠前庭终器、Scarpa’s神经节、基底膜、螺旋神经节中的表达。方法：运用RT-PCR技术分别检测大鼠前庭终器、Scarpa’s神经节、基底膜、螺旋神经节编码N型乙酰胆碱受体α10亚基的基因表达。以大鼠脑组织RNA为阳性对照。结果：在前庭终器和基底膜上扩增出标志N型乙酰胆碱受体α10亚基基因

2、表达的PCR产物。结论：N型乙酰胆碱受体α10亚基在大鼠前庭终器、基底膜上有表达，在Scarpa’s神经节、螺旋神经节中无表达。为乙酰胆碱是内耳重要的神经递质之一提供了支持，并为更完整的理解N型乙酰胆碱受体在内耳中的传入－传出调节中的作用提供了依据。关键词：α10nAChR；耳蜗；前庭；逆转录－聚合酶链反应技术；大鼠1.引言乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）是哺乳动物中枢神经系统中最丰富和功能最重要的抑制性神经递质之一。N型乙酰胆碱受体（NicotinicAcetylcholineReceptor,nAChR）属于配体门控离子通道超家族成员之一，他们

3、支持着神经系统的化学突触传递。这些nAChRs由我[1,2]们已知的十一种亚基：α2-9和β2-4nAChR组合而成，大多数为两个α亚基和三个β亚基组成一个nAChR。但α7和α9亚基可独自形成有功能的同源性受体（homomericreceptor）[3-6,7]。由α7和α9亚基分别组成的同源性受体较其他异源性受体（heteromericreceptor）[8,9]具有高钙通过性的特点。人们曾对α9亚基形成的同源性受体特别感兴趣，它可介导耳蜗外毛细胞（outerhaircell,OHC）的胆碱能传出调节作用（modulationofcholinergic[10

4、]efferent）,这一功能是通过激活AChR引起短暂钙内流而激活钙依赖性钾通道，引起超极[11]化来实现的。在蟾蜍卵母细胞中，α9亚基可形成同源性受体，此受体可被ACh激活，其[7]特性与报道的大鼠耳蜗α9受体相似但在大鼠OHC中记录到的ACh诱发电流较其他同源性受[12,13,8][14]体如：α7、α8要小。这些数据提示虽然α9亚基可形成同源性受体，但更可能是需要其他亚基才能功能完备。但将α9分别与其他已知α亚基（α2-7）一起表达，并未得[7][15]到有功能的受体。由此推测α9亚基可能与新发现的一个nAChR亚基α10共同表达，形成一个功能完备的受体

5、。本实验目的在于建立证明α10nAChR亚基是否在内耳前庭、耳蜗中表达的方法，为进一1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20020487062）资助。-1-http://www.paper.edu.cn步阐明nAChR介导的毛细胞胆碱能传出调节作用提供分子生物学基础。2.材料与方法2.1材料制备动物和组织准备：在本研究中，每次使用4只大鼠，重复3次，共使用12只大鼠。大鼠断头后迅速取出颞骨，在解剖显微镜下分别分离出前庭终器（椭圆囊、球囊、壶腹嵴）、Scarpa’s神经节、耳蜗基底膜、螺旋神经节，直视下取出一只大鼠部分脑干组织作为阳性对照。提取总

6、RNA：使用TrizolReagent(Invitrogen,USA.)RNA提取试剂，依照说明书方法分别提取前庭终器、Scarpa’s神经节、耳蜗基底膜、螺旋神经节及脑干组织总RNA。逆转录反应：使用M-MLV逆转录酶和Oligo-dt作为引物，逆转录mRNA得到cDNA。20ul反应体系包括5×RT缓冲液（已含Mg2＋）4ul；4种dNTP（各10mmol/L）2ul；Oligo-dt引物50pmol；RnaseInhibitor(Progrema,USA.)20U；M-MLVReverseTranscriptase(Promega,USA.)100U；RN

7、A2ul；加去离子水至20ul。循环条件：37℃60min；99℃5min；5℃5min。产物置于－20℃保存备用。2.2PCR反应引物制备：根据Genebank发布的大鼠nAChRα10亚基的mRNA序列（AF196344）。运用PrimerPremier5.0引物设计软件，设计一对外围引物和一对巢式引物（见表1）。表1用于分析大鼠脑干组织和耳蜗基底膜、螺旋神经节、前庭终器（椭圆囊、球囊、壶腹嵴）、Scarpa’s神经节组织α10nAChR亚基的引物引物引物序列产物大小α10S5'-GTTTCTGCTGCTGCTGTTTCT-3'239bpAS5'-GGTAG

8、GCATCTGTCCAC