转录因子IRF4在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及与其预后关系的研究

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1、郑州大学硕士学位论文转录因子IRF4在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及与其预后关系的研究姓名：王姣杰申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：宋永平20070501郑州大学2007届硕士毕业论文转录因子IRF4在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及与其预后关系的研究种骨髓瘤相关癌基因，是干扰素调节因子家族中的成员，较其它成员特异表达于淋巴细胞。IRF4属于转录因子的一种，在基因调控中起重要作用，其异常表达是由于t(6：14)(P25：q32)染色体异位，即IRF4异位到第14号染色体IgH增强予位点，导致MUMl蛋白过表达，从而促进肿瘤形成。IRF4／MUM

2、l能促进成纤维母细胞的转化以及其缺失的淋巴细胞凋亡增加均提示其癌基因的范畴。既往资料表明IRF4在大多数多发性骨髓瘤患者中异常表达。近来研究报道IRF4／MUMl在弥漫性大B细胞淋巴瘤中有50％-75％的阳性率，但其与预后的关系目前仍不能确定。为明确IRF4／MUIll与DLBcL临床预后的关系。深入探讨DLBCL的发病机制，以及寻找治疗DLBCL新方法和新途径，我们进行了这方面的研究。研究分两部分进行，第一部分为临床研究，以临床确诊的DLBCL病人为研究对象，免疫组化方法检测IRF4的表达情况并观察IRF4阳性及阴性患者的生存期，探讨IRF4的表

3、达与DLBcL的预后关系?第二部分为体外研究，以B淋巴瘤细胞株Namalwa和Daudi为研究对象，利用不同浓度的阿霉素联合万珂(Velcade)作用于细胞株，探讨转录因子IRF4在其中的表达及与化疗药物耐药的关系，同时观察蛋白酶体抑制剂Velcade对IRF4的影响，为临床治疗提供理论依据。研究对象与方法1、收集河南省肿瘤医院和上海交通大学医学院附属瑞金医院2001--2005年经病理确诊的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者及其病理腊块标本，患者共有95例，男性58例，女性37例；年龄18—84岁，中位年龄5l岁。免疫组织化学方法探讨IRF4的表达情况，将

4、患者分为IRF4(+)组和IRF4(一)组，随访两组患者，探讨2年无病生存率和总生存率有无差别。2、B细胞淋巴瘤Namalwa和Daudi细胞株培养于含10％胎牛血清的RPMI一1640培养液中，置于37"C、5％C02、饱和湿度的培养箱，两天传代一次。3、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验应用96孔细胞培养板，每孔接种2×10‘个细胞于200Il1RPMll640培养体系中，分别加入不同浓度的阿霉素(0、5、10、20、30、50、lOOng／m1)；对于Namalwa细胞株，Velcade15nM联合加入不同浓度的阿霉素组。每种用药浓度设三复孔并

5、设不加药的对照组，放置于37"C、5％C0：、饱和湿度的培养箱中培养48d'时后，每孔加入5mg／mlMMT20Il1继续培养64,时，取出2000转／分离-I=l,lO分钟，小心lI郑州大学2007届硕士毕业论文转录因子IRF4在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及与其预后关系的研究吸弃培养液，加入200u1DMSO，振荡溶解后于570nm波长酶标仪测定各孔的光密度值(0D)，计算细胞生长抑制率[细胞生长抑制率=(对照组oD值一加药组0D值)／对照组0D值】。4、AnnexinV检测凋亡：不同浓度的阿霉素和Velcade及两药联合进行细胞凋亡刺激后，收

6、集并洗涤细胞，用AnnexinV—FITC方法标记，随即应用流式细胞仪分析AnnexinV—FITC标记的待检细胞凋亡情况。5、抽提RNA收集Daudi和Namalwa细胞株以及Namalwa细胞株不同用药组(阿霉素50ng／m1、Velcadel5nM和两药联合)、不同用药时间(12、24、48、72d,时)的细胞各3×106，常规Trizal法抽提总体RNA。分光光度仪测量RNA浓度，琼脂糖电泳检测RNA质量。6、RT—PCR和半定量RT—PCR检测IRF4的基因表达20II1体系取2．5IIg总体RNA用逆转录酶M-MLV合成cDNA。取2u

7、1cDNA进行PCR反应扩增IRF4基因，B—globin做为对照。具体方法参照操作指南。IRF4的引物序列是57一AGAACGAGGAGAAGAGCATC一3．和5’一CcTTTAAACAGTGccC从G一3’，PCR产物为114bp；B—globin的引物序列是5’一TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG一3’和5’一ACAC从CTGTGTTCACTAGC一3’，PCR产物为216bp。7、Western杂交检测IRF4蛋白表达收集Daudi和Namal霄a细胞株以及Namalwa细胞株不同用药组(阿霉素50ng／ml、Velcadel5

8、nM和两药联合)、不同用药时间(12、24、48、72d,时)的细胞3×10'，用100ll1Laemli缓冲液(62．5