晚期糖化终末产物在糖尿病大鼠骨质疏松发病中的作用

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1、晚期糖化终末产物在糖尿病大鼠骨质疏松发病中的作用中国老年学杂志2000年第5期第20卷实验研究作者：孔德娟　李恩　陈永春　佟晓旭单位：河北医科大学生化教研室，石家庄　050017关键词：晚期糖化终末产物；糖尿病性骨质疏松；骨密度　　摘　要　目的　探讨晚期糖化终末产物(AGE)在糖尿病骨质疏松发病中的作用。方法　用链脲佐菌素制做糖尿病大鼠模型，3个月后测定大鼠腰椎骨密度及骨胶原中AGE的含量及观察血、尿生化指标的变化。结果　糖尿病大鼠骨胶原中AGE的含量与正常对照组相比明显升高(P＜0.001)，而骨密度明显降低(P＜0.02)。24h尿钙增加，血钙降低。

2、结论　糖尿病大鼠骨胶原中AGE含量的增加所导致的成骨作用降低，可能是糖尿病骨质疏松发病的主要原因。　　晚期糖化终末产物(AGE)是糖的醛基或酮基与蛋白质等自由氨基，在非酶促反应中首先形成可逆的希夫氏碱(Schiff-base)，再经一系列脱水、氧化等反应，形成一类具有特征性荧光的化合物〔1〕。血糖的增加及富于自由氨基的蛋白质则有助于该物质的形成。糖尿病患者，由于胰岛素相对或绝对不足引起血糖升高，是AGE形成增加的主要原因〔2〕。而骨胶原中的大量自由氨基，是AGE的主要形成部位。蛋白质一旦经糖化终末产物修饰，则改变其生物学活性〔3〕。而在骨形成过程中，成骨

3、细胞对骨组织中Ⅰ型胶原的吸附是骨形成开始的先决条件。因此，本文通过测定糖尿病大鼠骨胶原中AGE含量及糖尿病大鼠的骨密度，探讨糖尿病骨质疏松的发病机制。　　1　材料和方法　　1.1　实验动物　实验选用体重200～250gWistar大鼠20只。适应环境1w后，随机分为2组，即正常对照组、病理模型组。病理模型组以60mg/kg体重链脲佐菌素(溶于柠檬酸缓冲液中pH4.5)经腹腔注射。正常对照组注射等量柠檬酸缓冲液，普通饲料喂养，自由饮用自来水，1w后，尾静脉取血，测定血糖，血糖浓度＞15mmol/L被选入实验。常规喂养80d后，禁食24h收集尿液。大鼠经股动

4、脉放血收集血液，离心取血清待测。取大鼠腰椎L1～L4做骨密度测定，取右侧股骨和胫骨放-70℃冰箱，用于测定骨胶原中AGE相对含量。　　1.2　血尿生化指标的测定　血钙、血磷、血糖、血碱性磷酸酶、尿钙、尿磷、尿肌酐均采用全自动生化分析仪检测，尿羟脯氨酸采用氯氨T氧化比色法测定。　　1.3　骨密度和骨胶原AGE的测定　采用SD1000骨矿物测定仪测定大鼠第三腰锥(L3)骨密度。骨胶原中AGE含量的测定：从-70℃冰箱取出骨标本后，沿骨纵轴剪开，用冰冷的PBS(pH7.4)冲洗骨髓腔数次直至冲洗液PBS无红色为止。滤纸吸干水份后，放入液氮中，30min后取出，

5、在研钵中用力研磨，过20目不锈钢筛，称取20目以下的骨颗粒20mg，在0.5MEDTA(pH7.4)中，4℃脱钙72h，每24h换液一次。脱钙骨粉经5ml氯仿甲醇(2∶1V∶V)脱脂12h。加入甲醇2ml、蒸馏水0.5ml，650g离心10min。吸弃上清，沉淀经5ml甲醇洗2次，去离子水洗3次，再用含0.1mol/LCaCl2的0.02mol/LHepes缓冲液(bufferHpH7.5)洗2次。BufferH中4℃过夜。离心，除去BufferH，骨颗粒沉淀重新悬浮在1.0ml含280UⅦ胶原酶的BufferH中，同时加入2μl氯仿和2μl甲苯以防细菌

6、生长，水浴摇床中37℃消化24h。10000g离心5min。以激发波长370nm，发射波长440nm处测定上清中的荧光强度，含胶原酶Ⅶ的bufferH作空白对照。上清再经6mol/L盐酸110℃水解24h后，用于羟脯氨酸的测定。以胶原中羟脯氨酸的含量为14%，计算出胶原含量。AGE的含量以每毫克胶原中相对荧光强度(RF/mg)表示。　　1.4　统计学分析　所有数据均以x±s表示，数据用计算机统计软件PSI运算处理。　　2　结　果　　2.1　血、尿生化指标的变化　病理模型组与正常对照组相比血钙明显降低(P＜0.05)，尿钙明显增加(P＜0.05)，而血碱性

7、磷酸酶显著升高(P＜0.001)(表1)。病理模型组与对照组相比血糖显著升高(P＜0.01)，病理模型组血糖在注射链脲佐菌素(STZ)7d后和90d无统计学差异(表2)。表1　血、尿生化指标的变化(±s)组别n血Ca(mmol/L)血P(mmol/L)血ALP(IU/L)尿Ca(μmol/24h)尿羟脯氨酸(μmol/24h)正常对照组102.46±0.071.99±0.4150.8±13.364.6±0.291.04±0.43病理模型组82.21±0.251)1.60±0.52205.5±51.372)24.0±7.401)1.27±0.36　　注：病

8、理组与对照组相比：1)P＜0.05，2)P＜0.001表2　各组大鼠血糖的变化(