子宫内膜异位症不孕患者腹腔液IL-2活性及外周血T细胞亚群变化

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1、子宫内膜异位症不孕患者腹腔液IL-2活性及外周血T细胞亚群变化　　第三军医大学学报1999年第21卷第10期胡珊　史常旭　　提　要　目的：探讨子宫内膜异位症导致不孕的免疫机制。方法：选择临床轻度子宫内膜异位症不孕患者，以多囊卵巢综合征及不明原因不孕的患者为对照。采取CTLL细胞株法检测腹腔液IL-2生物活性，以流式细胞分选技术检测外周血T淋巴细胞亚群的变化。结果：与对照组比较，轻度子宫内膜异位症不孕患者腹腔液IL-2活性显著增高，外周血CD+4T细胞数目增加，而CD8+T细胞变化不明显。结论：轻度子宫内膜异位症不孕患者腹腔免疫细胞处于高度活化状态

2、、全身存在免疫异常。提示高水平IL-2与子宫内膜异位症导致不孕有关。　　关键词：子宫内膜异位症　不孕症　白细胞介素-2　T淋巴细胞亚群　　子宫内膜异位症(Endometriosis，EM)为生育期妇女最常见的疾病之一。不孕病人中25%～50%患有此病。但EM导致不孕的机制一直不十分清楚。近年的研究提出免疫机制可能参与EM不孕的病理生理过程。细胞因子作为细胞间相互作用的重要信使分子，引起广泛关注，认为细胞因子的异常很可能是造成不孕的直接原因。本实验以轻度EM不孕患者为研究对象，应用CTLL细胞株法检测了EM组及对照组腹腔液IL-2生物活性，应用流式

3、细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群的改变。旨在了解EM不孕患者的免疫状态，探讨其在EM不孕中的意义。　　1　材料和方法　　1.1　主要试剂　　淋巴细胞分离液(上海试剂二厂，比重1.077±0.002)、RPMI1640培养液(Gibco公司)、IL-2依赖性CTLL细胞株(ATCC公司)、抗CD4-FITC及抗CD8-FITC单抗(北京邦定公司)　　1.2　观察对　　于非行经期施行腹腔镜检查术。排除全身性疾患(包括感染)，术前3个月内未使用过任何激素及免疫制剂。　　EM组：25例，年龄24～34岁，平均26.5岁，均为因不孕经腹腔镜检查诊断为轻度EM

4、的患者，其中单纯性EM22例，合并慢性输卵管炎3例。　　对照组：15例，年龄24～32岁，平均27.1岁。均为因不孕行腹腔镜检查的患者，12例诊断为多囊卵巢综合征，其中合并慢性输卵管炎4例;正常盆腔3例。　　EM诊断依据：腹腔镜下依照Acosta［1］分类标准，轻度EM表现为：子宫直肠窝、膀胱反折腹膜、子宫骶韧带或盆腔腹膜有分散的泡状、息肉样及片状，呈红色、暗红色或紫色等新、老的异位内膜灶，卵巢及输卵管周围无粘连，无巧克力囊肿。　　多囊卵巢综合征诊断依据：腹腔镜下见双侧卵巢增大或正常大小，包膜增厚呈珍珠色，表面光滑，卵巢包膜下可见多个滤泡，无排卵

5、痕迹，部分患者卵巢表面可见血管。　　慢性输卵管炎诊断依据：腹腔镜下示输卵管迂曲，轻度或中度肿大，伞端可部分或完全闭锁，与周围组织粘连，或输卵管积水，或输卵管粗细不均。输卵管美蓝生理盐水通液检查提示输卵管通而不畅或不通。本研究中慢性输卵管炎患者腹腔镜下盆腔形态、解剖正常，仅输卵管通液检查示一侧输卵管不通或通而不畅，另一侧通畅者。　　1.3　实验方法　　1.3.1样本采集　　1.3.1.1　收集腹腔液　　常规局麻下行电视腹腔镜检查术。顺序观察盆腔，经操作孔插入导管，抽吸子宫直肠窝腹腔液5ml，立即置预冷含肝素的离心试管内。4°C离心，3　000r/m

6、in×5min。将离心的上清分装，冻存于-20°C待测。　　1.3.1.2　收集外周血及分离外周血淋巴细胞　　腹腔镜检查手术当日取患者肘静脉血5ml，肝素抗凝，室温(18～28°C)保存(＜12h)。常规方法分离外周血淋巴细胞。以无菌注射器抽取5ml淋巴细胞分离液，连接9号腰穿针，插入装有充分混匀血液的离心试管底部，渐渐注入分离液，立即置水平离心机，2　000r/min×20min。吸取血浆和分离液之间呈乳白色的淋巴细胞，至D-Hank's溶液内，离心洗涤2次，1　000r/min×10min，弃上清，管底淋巴细胞重悬于冻存剂中，-196°C液氮

7、保存。　　1.3.2　腹腔液IL-2活性的测定［2］　　取生长良好的CTLL-2细胞，用RPMI1640洗涤2次，悬浮于含10%灭活小牛血清的完全RPMI1640培养液中，调整细胞浓度为1×105/ml。在96孔培养板中，每孔加入细胞悬液100μl，再分别加入1∶2稀释的待测腹腔液上清及倍比稀释的标准品100μl/孔，平行3孔。设10%FCSRPMI1640100μl+CTLL-2细胞悬液100μl(1×105/ml)为阴性对照。培养物置37°C5%CO2中培养24h，每孔加入3H-TdR1μCi/ml，继续培养6h。收集细胞于玻璃纤维滤纸上，晾

8、干后用计数仪检测细胞的3H-TdR掺入值(即cpm值)。　　1.3.3　T淋巴细胞亚群的检测　　采用流式细胞技术，快速复温冻存的淋巴细胞