从鲎试剂生产废料中提纯鲎素的方法研究

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1、从鲎试剂生产废料中提纯鲎素的方法研究【摘要】目的建立从鲎试剂生产废料中纯化鲎素的方法。方法用酸处理和sephdexG50凝胶层析法从鲎试剂生产废料中提纯鲎素。结果经凝胶层析纯化样品在SDSPAGE中显示单一蛋白质条带。鲎素分子量约3kD左右。提取的鲎素能显著抑制大肠杆菌的生长，IC50为3.9mg/L。进一步研究显示，提取到的鲎素不仅抑制普通大肠杆菌的生长，而且可以显著抑制耐氨苄青霉素或耐卡那霉素的大肠杆菌的生长。结论本文建立的方法可成功地从鲎试剂生产废料中提取到纯化的鲎素。【关键词】鲎素；纯化；抑制；废料基金项目:广东省重点学科经费资助，广东省

2、中医药局基金资助项目［2006］］（No.1050047），湛江市科技计划项目（2005）PurificationoftachyplesinfromthewastesoftachypleusamebocytelysateCHENWeizhu，WANGYajun，ZHANGHaitao　DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023,ChinaAbstract:ObjectiveToestablishafeasiblemetho

3、dforpurifyingtachyplesinfromthewastesoftachypleusamebocytelysate(TAL).MethodsTachyplesinwasextractedfromthewastesofTALbyacidationandgelchromatography.ResultsThepurifiedsampleappearedsinglebandonSDSPAGE.Themolecularweightofpeptideisabout3kD.TachyplesininhibitedEscherichiacolias

4、wellasampicillinresistantorkanamycinresistantEscherichiacoli,withIC50of3.9mg/LforEscherichiacoli.ConclusionThepresentmethodisfeasibleforpurifyingtachyplesinfromthewastesofTAL.Keywords:tachyplesin;purification;inhibition;wastes节肢动物门动物的淋巴细胞中存在多种抗菌蛋白质和肽类，这些物质作为动物免疫防卫系统中的重要成员，在抵抗

5、微生物的感染中发挥着重要作用［１］。鲎血细胞目前主要用于制备鲎试剂，广泛用于药品的内毒素检测。其生产的废料是不溶于水的细胞膜，我们前期的研究发现在这些生产废料中含有大量抗菌、抑制内毒素反应的活性蛋白质（多肽），这些物质抗菌效果好，稳定性佳，存在很大的利用价值［2］。目前尚未见报道从鲎试剂生产废料中提取鲎素的研究，建立从鲎试剂生产废料中纯化鲎素的方法，可为对进一步开发鲎素奠定方法学基础。本文对这一抗菌肽作了提纯方法的研究，并对抑菌效果作了观察，现将结果报道如下。1材料与方法1.1试剂与仪器SephadexG50(Pharm)，四甲基乙二胺，丙烯酰胺，

6、N，N一甲叉双丙烯酰胺，考玛斯亮蓝，十二烷基硫酸钠，甘氨酸，蛋白胨,酵母提取物。自动低压液相色谱分离层析仪（上海，嘉鹏），CF16RX冷冻离心机（日本），VARIOSKANFLASH连续光谱荧光酶标仪（美国），FluorChemTMSP全自动荧光化学发光可见光数字图像分析系统（美国），BioRad垂直电泳槽（美国），UV2100分光光度计（上海，尤尼柯）1.2鲎试剂生产废料的处理［2］从鲎试剂生产厂家收集鲎试剂生产废料用蒸馏水漂洗2次，将沉淀悬浮于20mmol/L盐酸溶液，匀浆，8000r/min离心30min，收集上清液，备用。1.3凝胶层析分

7、离蛋白质与蛋白质定量［23］将上清液用SephadexG50分离，20mmol／L盐酸洗脱，流速1.0mL／min，收集280nm具光吸收峰物质。共收集三个洗脱峰。用考玛斯亮蓝法测定蛋白质质量浓度。1.4洗脱峰样品聚丙烯酰胺凝胶电泳分析加入等体积的2×上样缓冲液(62.5mmol/LTris,10%甘油,2%SDS,0.02%溴酚兰,5%β巯基乙醇)。12%的分离胶:H2O1.6mL,30%丙烯酰胺溶液2.0mL,1.5mol/LtrisHCl(pH8.8)1.3mL,10%SDS0.05mL,10%过硫酸铵0.05mL

8、,TEMED0.004mL。电泳缓冲液:25mmol/LTrisHCl,250mmol/L甘氨酸,0.1%