美国USP鲎试剂检测方法.doc

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1、USP这一章节的部分内容已与欧洲药典和日本药典协调一致，不一致的部分以符号*标出。本章阐述了关于检查和定量供试品内毒素的方法。本法利用鲎（Limuluspolyhemus或Tachypleustridentatus）血细胞提取物制备的用于内毒素检测的鲎试剂（LAL）检定内毒素。*除内毒素之外，LAL试剂也与β-葡聚糖反应。检定含β-葡聚糖的供试品时，必须使用不与β-葡聚糖反应的LAL试剂。该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程

2、中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。检测时，可用其中任一种方法进行试验。当测定结果可疑或有争议时，除非各论中另有规定，以凝胶法测定结果为准。直接比较供试品溶液与标准内毒素溶液，判断凝胶法的反应终点。内毒素含量以USP内毒素单位（USP-EU）表示。[注-1USPEU相当于1个内毒素单位。]LAL试剂专用于浊度检查法或显色法，因此，使用这两种方法进行检定时，必须符合它们各自的要求。两种检查法都要求建立标准曲线，以检定供试品的内毒素含量。主要的实验步骤有：在预定的时间内将内毒素和对照品分别与LAL试剂保温培养；读取相应波长处的吸光度等

3、。使用终点浊度法时，应在孵育时间结束时马上读数；对终点显色法，则要在孵育终止时添加酶反应-终止制剂，反应停止后，方可读数。动态浊度法和动态显色法分析整个反应时间内吸光度的变化，并通过这些读数计算比值。仪器所有玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。*钝化内毒素的方法见药典的“灭菌和无菌保证（1211）”章。试验时，选用灵敏度不低于0.15内毒素单位/mL的LAL试剂。去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。[注-本章内，“管”也包括任何其他

4、反应容器，如微孔板的孔等。]内毒素储备标准溶液和内毒素标准溶液的制备USP内毒素RS的效价规定为10000USP内毒素单位（EU）/西林瓶。用5mLBET检查用水溶解1西林瓶中盛放的RSE*2，在漩涡式搅拌机中溶解，用时为30分钟，在此过程中应不时搅拌；用得到的浓缩液制取系列稀释液。如不打算马上制取稀释液，应将浓缩液放在冰箱中保存，保存时间不得超过14天。从冰箱里取出浓缩液后，在使用之前，应用漩涡式搅拌机搅拌，搅拌时间不少于三分钟。稀释液在进一步稀释之前，也需要混匀，搅拌时间不得少于30秒。吸附会对稀释液的活性造成损失；因此，除非有可靠的数据能支持稀释液的保存，否则都不应该保留稀释

5、液。预备实验使用灵敏度经复核的LAL试剂。为保证内毒素检查法的效力，需要证明供试品溶液、洗液、或供试品的提取物对检查反应没有阻抑或增强作用，也不会给试验带来干扰。验证时，应对列出的三种方法分别进行阻抑或加强试验，阴性对照品也是验证的对象。当LAL试剂的来源、生产商的方法或试验用物品的配方发生变化时，需要重新开展验证。供试品溶液的制备制备供试品溶液时，应以LAL试剂用水溶解或稀释药品，或润洗供试药品的容器。也可能有其它的水溶液对某些物质或制剂的溶解、稀释或润洗能起到更好的效果。如有必要，调节供试品溶液（或它的稀释液）的pH值，使LAL试剂和供试品溶液的混合物的pH值在所选LAL试剂的

6、生产商建议的pH范围内。一般要求供试品溶液的pH值范围为6.0——8.0。可使用酸、碱或LAL试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用LAL试剂用水再已去除内毒素的容器中配置。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。确定最大有效稀释倍数最大有效稀释倍数（MVD）指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。这个概念对注射剂或需要复溶、稀释的非肠胃给药的溶液及某些给药剂量会因给药体积的变化导致药品用量变化的药品也适用。通常情况下，MVD按下列公式确定：MVD=内毒素限值×供试品溶液浓度/λ供试品溶液的浓度和λ的有关规定如下：各论中给出了以体积（EU/mL）表示的内

7、毒素浓度限值的定义。用限度除以λ（λ为LAL试剂的标示灵敏度，单位EU/mL），即得MVD。各论中，内毒素限值的单位是重量或有效成分的效价单位（EU/mL或EU/Unit），用它乘上供试品或按照标签说明复水的药品溶液的浓度（mg/mL或Unit/Ml）（两种做法均可行），得到的结果除以λ，得到的结果就是MVD因子。MVD是试验有效时，供试品可被稀释的最大倍数。确定内毒素限值根据剂量，注射剂的内毒素限度等于K/M的值*除鞘内注射给药（K为0.2USP-EU/kg体重）外