蛋白质的修饰和表达

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1、二、蛋白质功能的全新设计蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构和有用的功能。功能设计主要涉及键合及催化为达到这些目的可以采用两条不同的途径：反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；从头设计功能蛋白质蛋白质的功能设计１．通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能２．键合及催化的从头设计３．在全新蛋白质中引入结合位点４．催化活性蛋白质的设计５．膜蛋白及离子通道的设计６．新材料的设计蛋白质修饰的化学途径蛋白质修饰的分子生物学途径第四章蛋白质的修饰和表达氨基的化学修饰三硝基苯磺酸与赖氨酸残基反应，在420nm

2、和367nm能够产生特定的光吸收。亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反应可区分α-氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍保持在水溶液中的可溶性。α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε-氨基。羧基的化学修饰由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可在较温和的条件进行氧化和还原反应二硫键的还原：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内

3、二硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。5，5’二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Ellman试剂），可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放1个有很强颜色的TNB阴离子，可在412nm处通过光吸收的变化来监测反应的程度。Ellman是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂，还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状态及跟踪

4、构象变化的过程。化学修饰影响的条件1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件2、pH值得变化：决定了具有潜在反应能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态。3、温度：影响活性巯基的微环境4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机溶剂可使蛋白质变性。化学方法：产生半合成的结构，一个天然多肽与一个人造（或化学修饰）的多肽相缔合非共价缔合产生二硫键形成肽键产生非天然型的共价键非共价缔合在多肽链中如果出现一个切口，但多肽链并不因此分开，仍能保持其生物学活性。在变性系统中，破坏非共价键后，在非变性

5、基质中仍可形成原来的构型，活力也随之恢复。这一现象可用来产生半合成的类似物产生二硫键二硫键被还原剂打开，多肽彼此分开DTT、二硫苏糖醇将这些片断与适当的被修饰的或合成的另一肽相混合，通过重新形成二硫键而形成嵌合分子形成肽键通过酶连接反应形成肽键从猪胰岛素生产人胰岛素将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基（胰蛋白酶）通过酶法与活性酯偶联羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子产生非天然型共价键利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起。常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子中的赖氨酸残基侧链相连接。可以用主链肟键产生尾

6、-尾相连二聚体如：抗体制备具有不同功能的F（ab)2的类似物蛋白质改造的分子生物学方法突变：寡核苷酸介导的定向突变、PCR方法、盒式突变定向进化：异错PCR、基因家族改组技术表达体系原核表达：大肠杆菌真核表达：酵母、昆虫、哺乳动物细胞二、蛋白质改造的分子生物学途径定位突变：在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片断优点：突变率高、简单易行、重复性好应用：研究基因的结构与功能的关系；蛋白质结构与功能，读基因调控机理、疾病的病因和机理方面研究应用：寡核苷酸介导的定点突变、PCR方法介导的定点

7、突变及盒式突变随机突变优点：在体外模拟自然进化的过程常用手段：易错PCR、基因家族改组技术（DNAfamilyshuffling)等寡核苷酸引物介导的定点突变1、将待突变基因克隆到突变载体上2、制备含突变基因的单链模板;3、引物与模板退火，以5’端磷酸化的突变寡核苷酸引物,与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA,4、合成突变链:在DNA聚合酶的催化下,引物以单链DNA为模板合成全长的互补链,而后由连接酶封闭缺口,产生闭环的异源双链的DNA分子;5、将异源双链DNA分子转化大肠杆菌后,产

8、生野生型、突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学方法对突变基因进行筛选6、对突变基因序列进行分析寡核苷酸引物介导的定点突变的改进缺点：产生突变效率低，原因：大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统改进：KUNKEL用尿嘧啶取代DNA特点:1、采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体2、采用改进后的质粒，省去制备单链模板的步骤3、增加了多个抗生素筛选标志和相对应的多对敲除/修复引物，使质粒进行多次突变UUUUUUUUUUUUUUUUUU3’5’P模