蛋白质的修饰和表达03课件

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1、第三章蛋白质的修饰和表达9/18/20211主要内容第一节蛋白质修饰的化学途径(P88-94自学)第二节蛋白质改造的分子生物学途径第三节重组蛋白质的表达9/18/20212第二节蛋白质改造的分子生物学途径基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。分类：位点特异性突变基因突变技术（按特点划分）随机突变9/18/202131)通过寡核苷酸介导的基因突变位点特异性突变2)盒式突变或片段取代突变3)以双链DNA为模板，利用PCR技术进行的基因突变可以这样说

2、，PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。9/18/202141．编码基因的专一性位点突变定义：专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出现后变得更高效。(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法9/18/20215(1)寡核苷酸介

3、导的基因突变中的各种因素DNA模板的制备对于单链DNA模板一定要高纯度，即使少量的RNA分子都会影响突变的特异性。双链DNA：一般制备DNA质粒的方法均可单链DNA：通过M13噬菌体或噬菌粒来制备9/18/202169/18/202179/18/202189/18/202199/18/2021109/18/2021119/18/202112③核甘酸突变引物与模板DNA的退火和引物延伸条件对于突变引物与模板DNA的比率一般是双引物与模板之间的摩尔比在10～50：1之间。退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。原则：

4、退火温度为理论预测的Tm值以上20℃，然后再慢慢冷却至较低温度，形成双链。引物延伸加入延伸所需的dNTP、ATP、DNA聚合酶、DNA连接酶等。在适当温度下进行2—15h的连接。9/18/202113④DNA聚合酶的选择T4DNA聚合酶T7DNA聚合酶Klenow酶在单引物的延伸反应中，避免使用不当的酶引起引物置换，导致突变效率降低。9/18/202114⑤dNTP（脱氧核苷三磷酸）对立体DNA合成的影响dNTP纯度要高dCTP氧化脱氨可以产生微量dUTP，当多核苷酸中搀入UMP时，受体菌中的尿嘧啶-N-糖基

5、化酶可在U的位置切断DNA链，而细胞内的DNA聚合酶能够产生切口平移，从而降低突变体的产率。9/18/202115⑥受体细胞对突变体产率的影响大肠杆菌细胞内的几个错配修复系统解决方案：采用错配修复系统缺失的系统菌株作为受体菌。当用M13作为克隆载体时，M13可能会出现不对称复制，如果突变链复制率较低就影响试验结果9/18/202116(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法①Kunkel突变法②基于抗生素抗性“回复”的突变方法③基于去除特定限制酶切位点的突变④利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变9/18/202

6、117①Kunkel突变法Kunkel1985年建立的方法：9/18/202118具体步骤：将待突变的基因克隆入M13DNA载体上，导入具有dUTP酶（dut）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ung）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株中。Dut缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后进行DNA定点突变。双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶N-

7、糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基。结果原来的M13模板链被降解，只有突变链因不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。9/18/202119②基于抗生素抗性“回复”的突变方法9/18/202120③基于去除特定限制酶切位点的突变9/18/2021219/18/202122④利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变5’端或3’端区产生突变——直接PCR中心区突变——重叠延伸（overlapextension）新概念：GeneSOEing:即通过重叠延伸进行剪接（splicin

8、gbyoverlapextension）,也就是说通过重组延伸方法将不同的基因进行剪接和组合在一起。9/18/202123DNA片段的剪切9/18/202124取代突变9/18/202125插入突变9/18/202126缺失突变9/18/2021272．区域性定向突变基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法(cassettemutagenesis)，