第九讲 蛋白质的修饰表达

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1、第八讲蛋白质分子设计第一节　分子设计概况第二节　基于天然蛋白质结构的分子设计第三节　全新蛋白质设计第四节　计算蛋白质设计第五节　基于结构的药物分子设计第一节　蛋白质修饰的化学途径第二节　蛋白质改造的分子生物学途径第三节　重组蛋白质的表达一、功能基团的特异性修饰多位点取代单一的限制性取代次级取代二、基于蛋白质片段的嵌合修饰嵌合蛋白质—非共价缔合系统二硫键与嵌合蛋白质的形成嵌合蛋白质—通过化学激活形成肽键嵌合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键通过非肽键形成嵌合蛋白质第九讲蛋白质的修饰和表达虽然基因重组表达技术的应用对蛋白质结构功能的研

2、究以及蛋白质分子的改造提供了一条非常有效的途径，然而用化学方法直接对蛋白质分子进行修饰有时仍然是很有用的方法，可以弥补正常生物表达体系的不足。例如，利用化学法和酶法相结合，可以从猪胰岛素制备人胰岛素；通过区段特异性取代制备适合于肿瘤定位的抗体；对用重组方法得到的多肽进行C末端酰化以及制备各种类型的蛋白质嵌合体等。因此化学法和重组方法的相互补充，使蛋白质工程的实施更有效。蛋白质工程的化学方法通常是产生半合成的结构，在此结构中一个天然的多肽与一个人造（或化学修饰）的多肽相缔合。产生这种缔合的方法主要有4种：①非共价缔合、②产生二硫

3、键、③形成肽键以及④产生非天然型的共价键连接。第一节　蛋白质修饰的化学途径在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。对于氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在化学上很难将肽链的α-氨基或α-羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。很多在临床上重要的肽其C末端是被酰化的。但当用重组的方法得到

4、这些产物时，其C末端是自由羧基。在自然界能进行这种酰化作用的氧化酶体系很难实用化。寻找一种有效的方法，使C末端的谷氨酸和天冬氨酸酰胺化，而不作用于处在肽链中的谷氨酸和天冬氨酸仍是努力的方向。■一、功能基团的特异性修饰第一节　蛋白质修饰的化学途径氨基可用取代基进行修饰。常用的取代基有两种：t-butyloxy-carbonyl(Boc)是典型的酸不稳定取代基，而Methanesulphonylethyloxycarbonyl(Msc)是典型的碱不稳定取代基。这两种基团常用于对氨基进行临时保护，以防止其他反应试剂对氨基的作用。当其

5、他反应完成后，可分别用无水三氟乙酸和强碱将Boc和Msc基团去除，很多多肽或小分子蛋白质在这些基团去除后仍保持其活性。■一、功能基团的特异性修饰第一节　蛋白质修饰的化学途径★1.多位点取代※(1)常规的氨基保护绝大多数氨基取代反应至今尚无可靠方法将α-氨基和ε-氨基区分，但亚氨代乙酰化反应是一特例，尽管对α-氨基和ε-氨基的区分尚不完美。当ε-氨基几乎完全被亚氨代乙酰基取代时，α-氨基在很大程度上可不被修饰。被亚氨代乙酰基取代的氨基仍可解离。完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍保持其在水溶液中的可溶性，其性质与修饰前一样或相近，因此通常

6、在修饰后这一基团可不必从蛋白质分子上去除。只有在处于与蛋白质活性相关的赖氨酸残基的侧链被修饰后，导致蛋白质活性丧失。然而，亚氨代乙酰化反应在较低pH值下可形成烷基亚胺，N-烷基亚胺可进一步与赖氨酸侧链产生交联，从而影响被修饰蛋白质的活性。因此，在对ε-氨基进行修饰时，要适当地控制反应条件，使反应向着形成Nε-乙酰亚胺化的反应进行。★1.多位点取代※(2)亚氨代乙酰基羧基的甲基酯化一般可以在室温下将蛋白质加入到含有乙酰氯的无水甲醇中来完成。由于反应产生盐酸，需将反应物及时地稀释到冰水中，小心地用碱中和盐酸以使多肽或小分子蛋白质活

7、力得以保持。半胱氨酸出现在蛋白质分子中的概率比其他氨基酸要小。相对于其他功能基团而言，巯基有着十分不同类型的化学反应，因此半胱氨酸残基是一个很好的靶位，利用这一靶位可以将少数的取代基团引入到蛋白质分子的确定位置。当一对半胱氨酸通过二硫键相连时，通常可加入二硫苏糖醇之类的还原剂或通过磺酸氧化将其打开。用磺酸氧化的方法往往比简单还原的方法要好，因为磺酸氧化形成的半胱氨酸的磺酸化残基对氧化作用很稳定，而且可以通过巯基将其还原成自由琉基。★1.多位点取代※(3)其他的侧链取代用化学方法对蛋白质分子上单一的特定功能基团（如α-氨基）进行

8、修饰而不对与其相类似的基团（如ε-氨基）产生作用是一件很困难的事。少数的化学试剂，如α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε-氨基。由于酶蛋白可以将两个极相似的基团区分开来，所以可利用酶蛋白的这一特异性对蛋白质分子的功能基团进行特异性修