第九讲蛋白质的化学修饰与克隆（二）ppt课件.ppt

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1、第九讲蛋白质的修饰与克隆表达（二）第一节蛋白质的化学修饰第二节蛋白质的分子生物学改造第三节蛋白质(基因)的克隆（与）表达蛋白质化学修饰——复习蛋白质化学修饰的目的和意义？蛋白质化学修饰的主要部位是什么？什么是位点专一性修饰？亲和标记及其分类，与竞争性可逆作用的主要区别是什么？肽链中出现切开，蛋白质三维结构和生物活性还能保持吗？若变性和复性会发生什么现象，这一现象有何意义。提高蛋白质药物体内稳定性的策略。化学修饰？如何修饰？举例说明第二节蛋白质的分子生物学改造基因突变技术基因融合技术为什么要进行蛋白质改造？理论上，针对蛋白一级结构—高级结构—生物功能关系

2、问题应用上，针对蛋白质生物进化的适应性和生物活性的问题。工业用酶：体外稳定性差，易失活。高温、高压、有机溶剂环境活性低、易失活医用：抗原性、过敏反应、体内半衰期短等等因此，需要对蛋白进行改造，在理论上和实践上具有重要意义。为什么要利用分子生物学改造化学合成，尤其是批量人工合成蛋白，造价高成本大，很难满足研究和生产需要。生物体蛋白质合成的中心法则：基因→转录→翻译→蛋白质20th70S以来，PCR技术和DNA重组技术建立和发展，基因工程广泛应用，以及基因突变等基因改造技术的发展；（关键技术）分子生物学技术，已经成为蛋白质改造的有力工具，并形成一整套的技术，

3、具有其独特的优势。(基因的克隆、筛选、表达)优势：通过改变遗传密码。在一级结构上，能够随心所欲地改造蛋白质。在实践上已充分证实，并有许多成功的实例和借鉴，方法简便、易行。DNA合成的造价远远低于蛋白质的合成，当代，基因的合成已不是问题。蛋白质分子生物学改造的策略——经验热稳定提高，有助于耐有机溶剂、极端pH分子中引入适当的二硫键，显著提高稳定性在高温下，蛋白质Gln、Asn脱氨，影响生物功能，替换成其他合适的氨基酸。原核生物表达真核基因，重组蛋白表达高，但活力低——替换重组多肽中多余的Cys，降低错误折叠的可能性，提高表达产物的生物活性。提高酶催化活性根

4、据酶活性中心结构参数和催化反应机理，替换个别氨基酸残基，随机改造肽段，或删除末端氨基酸序列等。消除酶被抑制特性序列，强化配体—受体的亲和性，改善酶的催化特性。异源蛋白质药物，导致过敏——构建（人—鼠）嵌合基因，表达嵌合抗体，减少药物的抗原性。蛋白质基因改造方法：采用现代分子生物学技术——主要包括3种基因突变、基因融合、掺入非天然氨基酸等。以下简单介绍这三种技术，本节要求掌握前2种技术一、基因突变技术1、什么是？在基因水平上对其编码蛋白质分子的基因进行改造，通过其表达产物，来研究蛋白质结构和功能，或得到优良蛋白质分子菌种的分子生物学技术。2、技术先进性可称

5、为：蛋白质结构—功能关系研究的革命性变化；随心所欲、方便地研究特定氨基酸残基、特定结构单元，在蛋白质结构形成和功能表达中的作用；创造新型具有优良特性的蛋白质分子，满足应用的需要。3、类型（2种）定点突变和定向进化3、基因突变的分类基因突变定点突变（位点特异性）定向进化（随机突变）理性化设计非理性化设计3.1定点突变（sitedirectedmutagenesis）如何理解？在基因水平上，将DNA序列（基因）中某一特定位点碱基进行改变的分子操作技术。进一步理解取代、插入或删除——已知DNA序列中——特定的核苷酸，表达蛋白质结构中个别aa残基变化的——分子操

6、作技术。理性分子设计？定点诱变技术用来对蛋白质（酶）分子重新设计并改造其物理化学性能，同时可以进行酶分子的构象-功能相互关系的研究。在已知蛋白结构和功能基础上，有目的、有计划地设计和改变蛋白分子中某一活性基团和模块，从而产生新性状分子。因此称理性分子设计。特点：与物理、化学等自然因素诱变方法相比突变位点清楚、突变率高、简单易行、重复性好（1）定点突变的方案设计（一）定点突变设计和选择——突变aa或突变的bpDNA模板的制备——目的基因寡核苷酸突变位点的引物的设计和选择突变碱基的导入目的基因——PCR反应等方法反应条件选择和优化DNA聚合酶的选择dUTP对

7、基因合成反应的影响目的基因表达突变体的筛选及影响因素突变蛋白分离、纯化、功能测定简单介绍4种基本方法理解突变方案的设计Kunkel突变法基于抗生素抗性“回复”突变的方法基于去除特定限制酶切位点的突变方法基于聚合酶链式反应（PCR）的突变方法（2）定点突变的方法——简单介绍4种Kunkel突变法（试剂盒）制备U单链设计思路？制备目的基因模板导入突变碱基合成突变基因筛选突变基因PCRM13噬菌体设计思路Note：E.Coli菌株缺陷型(dut-ung-)dut-：dUTP酶ung-：尿嘧啶-N-糖基化酶问题：缺陷型？野生型？噬菌斑？关键步骤——制备含U目的基

8、因单链DNA模板基于抗生素抗性“回复”的突变方法制备和筛选目的基因Promega