蛋白质修饰的研究方法

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1、蛋白质修饰的研究方法人类基因组包含23,000个基因，然而，这些基因产生了显著更大的蛋白质组。这是由于在转录后和翻译后水平的多样性。单个基因在转录后，可以通过可变剪接，偶尔通过RNA编辑，产生多个mRNA分子。许多蛋白质在翻译后，通过蛋白质修饰和/或蛋白质剪切，产生成熟的和功能型的形态。通过广泛的翻译后修饰，蛋白质的结构和功能就多样性了。简介相比于基因组包含的全部基因，人类蛋白质组包含了更多的功能性多肽，部分归因于，翻译的同时和翻译后的蛋白修饰（图1A）。蛋白质组学研究的目的是获得存在于特定的细胞或组织类型，和存在于健康或患病组织的功能蛋白质的全貌。蛋白质组学研究的重要领域之一，是

2、识别那些翻译后修饰的蛋白质，及其修饰位点，确定修饰的功能以及在细胞功能网络中修饰蛋白的相互作用。[放大]图1.蛋白质修饰.A,翻译后修饰，以及可变剪接，在从单一基因生成多种功能蛋白的过程中发挥重要作用。B,翻译后修饰，作为细胞内信号（磷酸化），蛋白稳定性的调控（泛素），转录调控（组蛋白乙酰化和甲基化），细胞表面信号（糖基化）等多种多样的细胞功能中发挥重要作用。在过去的几十年，开发了多种方法测定蛋白质修饰。在这里，我们重点介绍识别蛋白质修饰的一般方法，质谱；识别磷酸化的特异性方法，磷酸盐标记；识别泛素化的方法；在染色质重塑过程中识别组蛋白乙酰化和甲基化的方法；识别蛋白质糖基化的方法（

3、表1和图1B）。详细的实验步骤以后将会整理归纳。修饰功能检测磷酸化细胞内信号转导·质谱·放射性测量分析·磷酸化特异抗体的免疫印迹泛素化蛋白质降解·质谱·泛素化检测乙酰化和甲基化转录的调控·染色质免疫沉淀·ChIP-on-chip糖基化细胞外信号转导·质谱·高效液相色谱法表格1.蛋白质修饰的类型，其主要的细胞功能，和主要的研究方法。初步识别新的修饰位点的一个主要方法是计算机分析。已经广泛应用计算机程序根据蛋白质的氨基酸序列识别假定修饰位点，这不是本文的讨论范围。计算机程序的概述见LiuandLi,2011[1]。质谱在过去20年来，质谱分析已成为确定蛋白质修饰类型和位点的必不可少的工

4、具。质谱分析可用于纯化的蛋白质或蛋白质的混合??物，例如细胞裂解液[2][3]。质谱仪从蛋白样品产生气相离子，根据质荷比(m/z)将其分开，并记录其丰度。质谱可用于多肽和蛋白质的分子量测定，多肽氨基酸序列的确定，和翻译后修饰的检测，以及多肽和蛋白质的相对定量。这种方法不能用于绝对定量。质谱分析的样品制备，用限制性内切酶如胰蛋白酶把蛋白质或裂解液消化成小分子多肽片段。然后蒸发和分析这些多肽片段，以确定其m/z值。由于酶切位点是已知的，所以就可以用计算机程序，根据质量确定每个肽段的特定氨基酸序列。由于磷酸基等分子的分子量和电荷是已知的，所以也可以检测肽段中特定氨基酸的磷酸化。基质辅助激

5、光解吸/电离(MALDI)肽图谱或纳升电质谱仪可以分析酶解消化的蛋白质样品。然而这些方法的局限是不能完全检测所有多肽片段，有些肽段清晰可见，有些肽段不可见。这对于复杂混合物的分析通常是一个主要问题，对于修饰肽段和翻译后修饰的分析，先用反相色谱分离多肽，然后馏分收集和用质谱分析(LC/MS)(图2B)[4]。为了更准确地确定肽段修饰的性质，经常用串联质谱(MS/MS)实验(图2A)。第一个MS步骤后，用惰性气体撞击多肽离子，从而导致进一步的碎片化。然后在第二个MS步骤分析这些多肽片段[5]。在此过程中，有些修饰肽段将保持不变，产生的肽段模式类似于中未相撞的肽段，有些肽段将显著碎片化，

6、产生的肽段模式可以为修饰氨基酸的性质和位点提供进一步的信息。图2.质谱作为一般的蛋白质修饰分析的工具。A,质谱（MS）分析是利用肽电离分析蛋白质碎片的质量电荷比(m/z)。进一步(MS/MS分析)，肽段进一步碎片化以获得更多的数据。B,LC-MS/MS,蛋白质的复杂混合物，通过液相色谱进行分离（左图），然后MS/MS（右图）确定每个多肽片段[21]。除了被用来确定单一蛋白质的修饰状态，质谱还被用来确定带有某种特定修饰如磷酸化的所有蛋白质的广泛数据集。这通常涉及到质谱分析前的亲和层析。这种技术被用于确定带有这种修饰的‘次级蛋白质组’，例如磷酸化蛋白质组分析癌症中整个信号网络的激活状态

7、[6]。质谱法已被用来确定上述所有四种修饰。然而，质谱分析较为昂贵，需要特定的设备，通常需要更多的定量数据，所以质谱分析通常是结合其他生化方法用于分析蛋白质的翻译后修饰。多种MS方法的更广泛的综述可参见[2],[3]。磷酸化磷酸化，或丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸残基增加一个磷酸基团，是蛋白质修饰最常见的形式之一(图3A)。在细胞内的信号转导通路，蛋白质磷酸化起着重要的作用，是可逆的，微调的信号[7]。几种体内的和体外的方法，被用于检测蛋白质的磷酸化状态，检测一个特定氨基酸的