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1、首都师范大学学报(自然科学版)第27卷 第6期JournalofCapitalNormalUniversityVol.27,No.62006年12月(NaturalScienceEdition)Dec.2006蛋白质的磷酸化修饰及其研究方法3张 倩 杨 振 安学丽 王爱丽 李巧云 晏月明(首都师范大学生命科学学院,北京 100037)摘要 蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰,它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组技术的不断发展,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文介绍了蛋白质磷酸
2、化修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质及磷酸化肽的标记和分离与富集、磷酸化肽及磷酸化位点分析以及蛋白质的磷酸化改性等方法,并综述了近年来国内外的主要研究进展。关键词:磷酸化,磷酸化蛋白质,磷酸化肽,磷酸化改性,质谱.中图分类号:Q753 蛋白质磷酸化(Proteinphosphorylation)是生物界胱氨酸磷酸化形成.最普遍,也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰(Post2蛋白质磷酸化具有以下功能:(1)磷酸化参与酶translationalmodifications,PTMs),20世纪50年代以
3、来作用机制,在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为一直被生物学家看作是一种动态的生物调节过程.S2或N2磷酸盐),如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依在细胞中,大约有1/3的蛋白质被认为是经过磷酸赖的磷酸转移酶系统(PTR)的组氨酸蛋白激酶[1]化修饰的.在人类基因组中,大约有2%的基因编(HPr);(2)磷酸化介导蛋白活性,蛋白分子通过蛋白[2]码了500种激酶和100种磷酸酶.蛋白质磷酸化激酶发生磷酸化,如蛋白激酶A(丝氨酸和苏氨酸残和去磷酸化是原核和真核生物细胞表达调控的关键基)或不同的受体酪氨酸激酶(
4、酪氨酸残基);(3)天环节,对许多生物的细胞功能起开关调控作用,是一冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应种普遍的重要调节机制.因此,蛋白质磷酸化的分析的感觉性传导中发生解离.和磷酸化位点的鉴定已成为目前蛋白质组学研究的2 磷酸化蛋白质及磷酸化肽的标记焦点之一.32传统磷酸化蛋白质分析大多利用P放射性标1 蛋白质磷酸化的主要类型与功能[3]32记.Lees2Miller和Anderson利用放射性P对人体磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大内的两种热休克蛋白进行了标记,最终鉴定出保守[4]
5、致可分为四类,即:O2磷酸盐、N2磷酸盐、酰基磷酸盐的丝氨酸磷酸化位点.deCarvalho等在昆虫细胞和S2磷酸盐.O2磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形表达了人的单核细胞中的细胞质磷脂酶A2,并采用32成的,如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸,羟脯氨酸或羟赖放射性P标记法鉴定出磷酸化蛋白及其磷酸化位氨酸磷酸化仍不清楚;N2磷酸盐是通过精氨酸、赖氨点.尽管人们至今仍广泛地运用放射性同位素标记酸或组氨酸的磷酸化形成的;酰基磷酸盐是通过天法分析蛋白质磷酸化,但是这种方法的固有缺点是冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成;而S2
6、磷酸盐通过半显而易见的.首先,这种方法存在放射性污染问题;其次,在某一专一蛋白激酶或者蛋白质体外磷酸化收稿日期:2005209227条件还不清楚的情况下,需要分析内源性蛋白质磷3通讯作者酸化时,这种方法就无能为力了.©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net44首都师范大学学报(自然科学版)2006年从20世纪80年代起,人们开始研究蛋白质磷力,可被选择性地
7、吸附在上面,现在微升级的IMAC[5][13,14]酸化分析的非放射性方法.Meyer等报道了用ABI柱被用来富集微量磷酸肽样品.在此方法中,键3+3+470气相蛋白质顺序仪固相法非放射分析磷酸化酪合在鳌合底物上的金属离子(通常是Fe或Ga)氨酸,并采用毛细管电泳鉴定从顺序仪上收集得到选择性地与磷酸化肽中的磷酸部分相结合,并且在的流出液中的磷酸化酪氨酸PTH衍生物.车发云高pH或磷酸缓冲液中磷酸化肽可以释放出来.此[6]等进一步建立了运用毛细管电泳同时非放射性分方法的优点在于每一个可溶磷酸化肽,不管
8、其长度析蛋白质或多肽中的各种O2磷酸化氨基酸的方法,如何都能被富集,而且IMAC柱洗脱下的样品可直可以在低pmol范围同时分析所有3种PTH2磷酸化接用于RP2HPLC分析.这种方法的局限性在于不能氨基酸,进而可分析蛋白质或多肽中磷酸化氨基酸与IMAC相结合的磷酸化肽和难于洗脱的磷酸化肽残基,运用此方法他们对3个模型磷酸化肽及天然可能会丢失.的磷酸化蛋白β2酪蛋白和卵黄高磷蛋白的磷酸化位312 免疫沉淀[7]点进行了分析.车发云和夏其昌还对磷酸化底物高亲和性抗体可以从
