整合素亲和性调控及信号转导功能与机制的研究

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1、密级：中国科学院大学UniversityofChineseAcademyofSciences博士学位论文作者姓名：韭盐指导教师：睦创坐受宜虽生国整堂陆±盎生金整堂班墨医生塑焦§!皇墅胞生塑堂班宜匮学位类别：堡堂簋±学科专业：细胞生物堂培养单位：生垦科堂院土盎生金整§塑珏宜医生塑化堂皇鲴雎生塑堂班宜匮2013年3月JIIIIIIIIIIIIIIIfY2431044AffinityRegulationandSignalTransductionofIntegrin．ZhangKunUndertheguid

2、anceofProf．ChenJianfengADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofScienceInstituteofBiochemistryandCellBiologyShanghaiInstitutesforBiologicalSciencesChineseAcademyofSciencesMarc

3、h，2013谨以此博士学位论文献给我的导师陈剑峰研究员我的父母张宪江、陈爱玲夫妇所有我关心的和关心我的朋友亲人摘要整合素亲和性调控及信号转导功能与机制的研究张坤(细胞生物学)指导老师：陈剑峰(研究员)整合素是一类重要的细胞粘附分子，是联系细胞内外的桥梁。一方面，整合素可以介导细胞与细胞，细胞与细胞外基质以及细胞与病原体之间的相互作用；另一方面，整合素还是一类重要的信号分子，可以双向传递跨膜信号。因此，整合素具有重要的生理功能，对于免疫反应、免疫细胞的组织定位、凝血、组织愈伤、癌细胞转移以及组织和器官

4、的发育等都至关重要。整合素生理功能的正常发挥依赖于其精确的配体亲和性调控及信号转导。虽然之前的研究工作在这两方面都取得了巨大的进展，但是还有很多问题尚待解决：整合素分子本身有很多精确的调控元件及相关的调控机制尚未被发现；整合素参与复杂的信号转导，但是目前发现的能直接与整合素胞内结构域相互作用的蛋白很有限；整合素是一类金属蛋白，正常功能的发挥依赖于二价金属离子的结合，生理条件下二价金属离子是如何动态调控整合素的生理功能的尚未被解决。因此，本论文主要从三个方面展开研究，拟希望能解答上述问题或为上述问题的

5、解答提供一定的提示。整合素ⅨⅡbp3、嘶p3及呶p2的晶体结构显示在整合素的膝盖部位有两对高度保守的二硫键，在本论文的第一部分工作中即对整合素嘶p7中的这两对二硫键(弛C589一C594和67C494．C526)展开了系列研究。研究发现：将这两对二硫键中的任一对或同时打开后整合素％B7高度活化；活化后的整合素并没有发生大的构象变化，但是却在细胞膜表面自动聚集(integrinclustering)并介导配体非依赖型的outside．in信号转导，活化整合素的下游信号分子FocalAdhesionKi

6、nase(FAK)及paxillin；重要的是，在一定的还原性环境中(0．1mM)，整合素蛳B7的这一对二硫键将特异性的被打开。因此，在本研究中我们发现了一种新的整合中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士学位论文1摘要素调控机制：在某些特殊的生理及病理，如病原体感染、免疫细胞的活化、抗原呈递等过程中，机体产生的还原性环境将特异性的还原整合素啦B7膝盖部位的两对二硫键，并诱导整合素分子在细胞膜表面的聚集，进而在没有配体存在的条件下介导细胞的铺展(cellspreading)并活化FAK等下游信号分子

7、，从而行使功能。在这部分的研究工作中，我们还通过噬菌体展示的技术方法，筛选到特异性识别直立构象整合素鼬B7的人源化抗体J19并进行了抗原表位的鉴定。该抗体是目前报道的唯一特异性识别直立构象的整合素0L4p7的抗体。该抗体的发现，不仅可以作为研究整合素CL4B，的活化机制及构象变化的有力工具，还可以作为检测体内整合素啦B7异常活化的标志，并用于诊断炎症的发生和开发靶向性治疗炎症性肠炎(InflammatoryBowelDisease，IBD)等疾病中。虽然整合素(除了p4整合素外)的胞内结构域都非常的

8、短小，只有几十个氨基酸，但是可以和多种胞内信号蛋白相互作用，是整合素发挥信号转导功能的重要组成元件。在本论文的第二部分工作中，为了寻找参与整合素信号传递的新信号分子，我们利用tailmodelprotein模拟整合素0L4p7的胞内结构域，从RPMl8866、K562等淋巴细胞及小鼠脾脏等组织中筛选全新的整合素胞内结构域的特异性结合蛋白，以揭示其所参与的信号传导途径及行使双向传递跨膜信号的生理机制。目前已经筛选到多个与嘶tail特异性结合的蛋白，并对其中的HSP90A