突变型前胰岛素原对β细胞功能的影响

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1、分类号：R587．1密级：学位类别：科学学位口专业学位团O学校代码：1062学号：20094044学科门类：医学又坪篑科鼻粤博士学位论文DoCToRALDISSERTATIoN论文题目：突变型(前)胰岛素原对B细胞功能的影响TITLEImpactofmutant(pre)proinsulinonthefunctionofBcells一级学科：二级学科：论文作者：指导教师：临床医学内科学内分泌与代谢病王瑜冯凭导师组成员：崔景秋天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标

2、注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：2013年5月15日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密囱。．(请在相对应的方框内打“4”)学位论文作者签名

3、：导师签名：日期：2013年5月15日日期：2013年5月15日天津医科大学博士学位论文中文摘要目的：本研究旨在探索与人类DM相关的突变型(前)胰岛素原在胰岛B细胞功能凋亡中的作用。通过检测6个具有不同生物学特性的突变型(前)胰岛素原C(A7)Y、OfB8)S、V(A3)L、R(SP6)H、G(C28)R及DelCys，对大鼠INS·1细胞凋亡及增殖的影响，同时比较不同突变型胰岛素原对内质网应激(ERS)和非折叠蛋白反应(切)R)信号通路的影响，探讨了突变型(前)胰岛素原导致B细胞凋亡的分子机制，为进一步提高糖尿病的治疗效果提供理论和实验依据。方法：1．研究突变型(前)

4、胰岛素原对大鼠INS-1细胞凋亡及增殖的影响用含小鼠野生型和6个含不同突变型小鼠前胰岛素原cDNA的重组质粒：m—WT及fll—DetCys、m—C(A7)Y、m—G(B8)S、m—V(A3)L、m—R(SP6)H、m-G(C28)R，分别转染入INS一1细胞中，设m_wT组、m-DelCys组、m_C(A7)Y组、m—G(B8)S组、m_V(A3)L组、m_R(SP6)H组、m_G(C28)R组。设衣霉素组为阳性对照组，vector组为阴性对照组。转染48h后，应用流式细胞仪检测INS—l细胞的转染效率，应用细胞凋亡试剂盒(AnnexinV-PE，7-AAD)检测IN

5、S-1细胞的凋亡情况，应用细胞增殖检测试剂盒(CellCountingKit-8)检测INS—l细胞的增殖情况。2．研究突变型(前)胰岛素原对ERS和UPR信号通路的影响实验分组同上，转染72h后，采用RT—PCR法检测细胞内ATF6mRNA和CHOPmRNA的表达水平，采用WesternBlot检测细胞内ATF6蛋白的表达水平。结果：1．研究突变型(前)胰岛素原对大鼠INS-1细胞凋亡及增殖的影响。(1)应用流式细胞仪检测转染48h及72h后的转染效率，发现各转染组转染效率相似，差异无统计学意义(F=0．966，P--0．464)(F--0．548，P--0．795)

6、。(2)转染48h后，检测细胞凋亡情况，发现：与衣霉素组相比，其它各组细胞凋亡率低于衣霉素组；与vector组相比，其它各组细胞凋亡率高于vector组；除衣霉素组及vector组外，m—DelCys组和m—C(A7)Y组的细胞凋亡率高于m-WT组、m-G(B8)S组、m-V(A3)L组、m-R(SP6)H组、m-G(C28)R组，差异有统计学意义(F=37．599，P=0．000)。(3)检测转染48h后细胞增殖情况，发现：与衣霉素组相比，vector组、天津医科大学博士学位论文m—wT组、m一6(B8)S组、m_V(A3)L组、旷R(SP6)H组、m-G(C28)R

7、组的细胞增殖高于衣霉素组；与vector组相比，其它各组细胞增殖低于vector组，差异有统计学意义(F=8．047，P=O．000)。2．研究突变型(前)胰岛素原对ERS和UPR信号通路的影响(1)转染72h后，与衣霉素组比较，m-V(A3)L组，m_R(SP6)H组，m-G(C28)R组，m-WT组ATF6mRNA及蛋白表达水平低；与vector组比较，其它各组ATF6mRNA及蛋白表达水平高；与m-DelCys组，m-C(A7)Y组和旷G(B8)S组比较，m-V(A3)L组，m．R(SP6)H组，IIrG(C28)R组，m_wT组A