大鼠急性脊髓损伤后紧密连接与血管发生在血脊髓屏障功能缺失中的机制研究

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1、中图分类号——IjlDC——博士学位论文学校代码!Q5三三密级公珏大鼠急性脊髓损伤后紧密连接与血管发生在血一脊髓屏障功能缺失中的机制研究ThestⅡdyof69Mj砌瞳c戗ons蛆dVasculo磬嬲isinBScBdys如nctionafterspiIIm—cord埘q碍’in吣作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：曹敏临床医学八年制脊柱外科湘雅医学院胡建中教授吕红斌教授论文答辩日期z堡：￡!皇甲答辩委员会主席型睦中南大学2013年5月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知

2、，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：么霖彩垒日期：．趁!；年上月埤日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论

3、文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。日期竺!年!月当八年制学位论文中文摘要摘要研究背景与目的脊髓损伤(spinalcordinjury，SCI)是严重危害人类生存和生活质量的一类中枢性神经创伤。随着全民运动的日益普及和越来越频繁的交通运输活动，脊髓损伤的发生率近年来有了显著的增高。研究表明，脊髓损伤后微循环障碍导致的脊髓缺血一水肿一自由基变化一水肿一缺血加重的恶性循环是造成脊髓神经组织不可逆的变性、坏死和细胞凋亡的主要过程之一。在这一过程中，血一脊髓屏障(bloodspinalcordbarrier，BScB)功能缺失导致的血管渗透性

4、增加是该恶性循环中的关键事件。本研究定性定量评估SCI前后脊髓血管内皮细胞间紧密连接的超微结构变化和紧密连接蛋白C1audin一5、Zo_1以及新生血管的空间分布和表达，探讨紧密连接与血管发生在脊髓损伤后BSCB功能改变中的作用和相关机制。方法1．80只SD大鼠用于本实验。20只SD大鼠作为正常组，60只SD大鼠利用改良Allen’s打击方法构建脊髓损伤模型后，随机分为损伤后1天组，3天组，7天组，每组20只。获取正常组和上述各时间点胸10(T10)段脊髓组织用于以下检测。2．利用透射电子显微镜观察正常与脊髓损伤后1天、3天、7天SD大鼠T10段脊

5、髓微血管紧密连接超微结构。各时间点样品数4只，共16只。3．利用组织免疫荧光技术和westernBlotting技术，对正常与八年制学位论文中文摘要脊髓损伤后1天、3天、7天SD大鼠TlO段脊髓紧密连接蛋白Claudin一5、Z0一l的空间分布与表达进行定性定量评估。蛋白荧光分析采用ImageProPlus软件。各时间点样品数4只，共32只，其中16只用于组织免疫荧光分析，余16只用于westernB10tting分析。4．利用组织免疫荧光技术，对正常与脊髓损伤后1天、3天、7天SD大鼠血管发生标记CD34+细胞的空间分布与表达进行2D评估。蛋白荧

6、光分析采用ImageProPlus软件。各时间点样品数4只，共16只。CD34分别与紧密连接蛋白Claudin一5、ZO—l荧光共标记。5．通过活体注射EB染料，在荧光显微镜下观察正常与脊髓损伤后1天、3天、7天BscB渗透性变化，定性分析正常组及脊髓损伤后各时间点BSCB功能。同时借助分光光度仪检测脊髓组织中EB含量，定量评估正常组及脊髓损伤后1天、3天、7天BSCB功能。各时间点样品数4只，共32只，其中16只用于定性分析，余16只用于定量评估。6．以上实验数据统计均采用SPSS13．0软件，组间比较使用T检验，P

7、1．紧密连接透射电镜观察证实，正常组大鼠脊髓血管内皮细胞间紧密连接呈铆钉状结构，构成相对封闭的血管管腔。在急性脊髓损伤后，细胞间紧密连接开放，在3天时细胞间隙增宽最为显著，之后随时问延续逐渐恢复，但在7天时仍未达到正常水平。II八年制学位论文中文摘要2．紧密连接蛋白Claudin一5、Z0一l组织免疫荧光结果发现，在正常组脊髓，紧密连接蛋白Claudin一5、Z0—1均与血管分布呈现高度一致性。在SCI后1天、3天、7天，上述蛋白均出现分布异常与不同程度的表达下降。其中在损伤后1天最为显著，之后随损伤时间延续逐渐恢复，但在SCI后7天，仍未恢复正常

8、水平。westernB10tt主ng结果同样发现，在SCI后l天，Claudin一5、Z0—1蛋白较正常组显著下降，并在S