染料木黄酮抑制大鼠脉络膜新生血管形成的实验研究

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1、华中科技大学博士学位论文染料木黄酮抑制大鼠脉络膜新生血管形成的实验研究姓名：陈晓申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：曾水清2003.4.1华中科技火学同济医学院2000级溥十学位论文染料木黄酮抑制大鼠脉络膜新生血管形成的实验研究华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科博士研究生：陈晓导师：曾水清教授摘要陬眨!!掺】脉络膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)性疾病是主要的致盲性疾病之一，其中以渗出型老年黄斑变性(age．relatedmaculardegeneration，AMD)最为常见。黄斑区CNV的形成是渗出型AMD的最主要特征，也是导致患者视功

2、能严重受损的直接原因。因此，如何抑制CNV的形成、促进其消退就成为了防治AMD的关键。：CNV的发生发展是一个复杂的病理过程，其中，脉络膜毛细血管内皮细胞的异常增生为最关键的一环，因此只要能够抑制血管内皮细胞的增殖就有希望能够抑制CNV。目前一般认为，在某些病理性刺激因素的作用下，血管新生因子和抑制因子动态平衡的失调(血管新生因子占了优势)是促进血管内皮细胞增殖、产生CNV的关键。目前发现的血管新生因子主要有：血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、碱性成纤维生长因子(basicfibroblastgrowth华中科技夫学同济医学院20

3、00级／8士学位论文factor,bFGF)、白细胞介素8(interlukin．8)、类胰岛素样生长因子(insulin+likegrowthfactor,IGF)及肝细胞生长因子(hepatocyte—growthfactor，HGF)等，其中又以VEGF为最主要血管新生因子。因此，如果能采用某种方法来降低VEGF的分泌和＼或对抗其生理作用就有可能抑制CNV的形成。：’，染料木黄酮(Genistein)是从大豆中提取的一种物质。它作为一种特异性酪氨酸蛋白激酶抑制剂，能够对抗VEGF对血管内皮细胞的促增殖作用，从而抑制新生血管的产生。已经有体外和动物实验证明，genistein能够抑制新

4、生血管的发生，但能否将其用于抑制CNV目前国内外尚未见报道。一：，々一、_，f．j，J渺知究genistein对大鼠cNV形成的抑制作用及在眼内应用的安全性，从而为药物治疗CNV提供一种可能的新途径。，／【方法】1)用半导体激光器(波长为810nm)对14只BrownNorway(BN)鼠的视≮乳头附近大血管之间的视网膜进行光凝，每眼光凝10点。于光凝后2h，3d，1、2、4、8及12周，分别行眼底荧光血管造影造影(fundusfluorescenceangiography，FFA)、吲哚菁绿血管造影(indocyaninegreenangiography，ICGA)以及光镜组织学检查，观

5、察激光光斑处CNV的产生及其变化过程。2)取体外培养的第三代人脐静脉内皮细胞(humanunbilicalveinsendothelialcells，HUVECs)用于以下的实验。(1)将上述细胞分为3组，实验组加入2．5ug·ml。的genistein，阴性对照组加入DMSO，空白对照组加入1640培养液，作用24小时后，用免疫组化技术对实验组和二对照组细胞VEGF、VEGFR2的表达情况进行检测，并对检测结果进行图像分析。(2)将上述细胞分为6组，每组分别加入四组不同浓度的genistein(1．25，2．5，5，10ug·ml。1)、DMSO、1640培养液作用48小时。免疫组化技术

6、和原位杂交方法检测各组细胞的增殖细胞核抗原(Proliferatingceltnuclear华孵412A学同济医学皖2000级博士学位论文antigen．PCNA)KmRNA的表达；3H—TdR掺入实验和MTT试验检测各组的CPM值及OD值；流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。3)(1)同“方法1)”，用半导体激光对BN鼠视乳头附近的视网膜进行光凝。将接受光凝后的20只大鼠随机分为二组，每组10只20眼。于光凝后l至2小时内向一组鼠的玻璃体腔内注射O．05ml、20lag·ml。1的genistein(实验组)，另一组注射等体积的DMSO(对照组)，第3天按同样方法再注射一次。第14天和第2

7、8天行FFA检查，分组计算荧光渗漏率及平均荧光渗漏强度。(2)另选未接受光凝的BN鼠5只，每只鼠右眼玻璃体注射0．05ml、20ug·ml。的genistein液，左眼注射等体积的DMSO溶液，第3天再注射一次。分别于第一次注射前、注射后1小时、1天及第二次注射后1小时，1天，1、2周行视网膜电图(Electroretinograms，ERG)检查。第二次注射后2周摘除眼球行光镜和透射电镜检查。【结果】1)用半导体激光对