寻常型银屑病患者皮损和血清中肿瘤坏死因子alpha及其受体的检测及其相关性研究

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1、中国医科大学博士学位论文寻常型银屑病患者皮损和血清中肿瘤坏死因子alpha及其受体的检测及其相关性研究姓名：高奎斌申请学位级别：博士专业：皮肤病与性病学指导教师：宋芳吉2002.4.1中文摘要前富锻屑病以表皮角质形成细胞过度增生和淋巴细胞浸澜为特征。免疫异常在茭发疯过程审起蓉重要撵周。免疫漉节主要是通过缨胞因子耀蔓作爱来实现的，银屑病皮损和／或外周血存在TNF一0【及其受体的异常。研究表明，银屑病皮损TNF—d的免疫反蔽性和生物学活镁明显升高。冻融的银属病皮损上潢液含有大量的TNF一伐；角威形成细腿、擞管穴皮缨胞和表皮树突状细胞上的粘附分子表达增高，角质形成细胞和真皮血管内波缨臆上的TNF一毡

2、表达增蠢，提恭TNF—o【珂麓逶过予颓镶稻病泼损区粘附分子表达而参与银屑病的发生。然而，并不能在银屑病皮损内始终如⋯地检测到TNF一俚。TNF一伐通过与其受体(TNFR)结合发挥其生物学效应。蠢掇遂镊屑病皮损处表皮全层和真皮血管周阑浸润细胞均表达TNFR—I，并认为’FNF一理可遵过与TNFR—l结合蔼佟耀予角藏形成缨胞等；镊鹅病友损表皮不表达TNFR—lI，真皮内漫润炎性细胞表达TNFR—II。随脂的研究发观银属病皮损表皮TNFR—I的含量明显增高，TNFR一Ⅱ轻度增高，并认为烈F一瑾受体熬局部或系统释放可戆调节TNF—a豹终爰效果。霹冤TN—FR—I和TNFR一Ⅱ在银屑病皮损处的表达仍不十

3、分明确。国内尚未见有关予TNF一貔及其受俸在银器病友损边缘外观正常皮肤表达与餐酌研究报道。近年来，人们对银属病患者外周血是否存在TNF一仪及其受体的异常褒达遴行了研究，Go畦等检淡2l傻寻常型镊属病患者蛊潘TNF一氆，结果羧明TNF一仪的水平无明显改变。随后的研究发现银屑瘸外周血TNF一啦豹血清水平明显升高。最近有人在对镊屑病患者巨细胞病毒与TNF一01．关系的研究中也观察到’r趣淳TNF一攫承乎增高。上述蓼}究缮果掇示黔餍盎TNF一旺可能参与了银屑病的发生。外周盘霹溶健TNF—d受体(sTNFRs)对体蠢TNF—o【的生物学活性起着重要的调节作用，假sTNFRs与银屑病方藤的研究报道很少。近

4、年来的研究发现缀屑病血清sTNFR—I的含薰明显增高；还有报道关节病测银·l·翳瘸羚岗蛊TIqF一氆含量降低，sTNFR—I和sTNFR一赣的活性上调。譬搽一FRs参与免疫避程，sTNFRs浓度反映细熬受疫活性，冬TNF—Ct穰其它可溶设免疫物质(slL一2R)等密切相关。同时检测银屑瘸皮攒和外周血TNF一伐及其受体求乎对子努析皮擐是部与整体TNF一程及其受体变纯酶关系非常必要。目前尚未见同时比较皮损局部与外周血TINF一仪及其受体变化的实验资辩。为此，本文应用免疫缝织化学方法对锻餍瘸皮按、皮援逡缘外溉正常皮肤榭F一仪及其受体的表达进行研究；用ELISA方法检测银屑病m清TNF—OC及其受舔禽

5、量，羧探讨皮摄和盎清TNF一氆菠其受诲在锻屑瘸发垒发展中的作用。圈内外尚未见银属瘸皮损表皮TNF一氆及其受体mRNA表达与否的研究报邋，本文应用RT—PCR方法梭浏寻常型银屑病患者皮损表皮TNF一瑾及其受俸的mRNA攘对囊，叛探讨TNF一往及其受俸mRNA黯辱常獭银屑病皮损TNF—a及其受体的影响。材料秘方法1．檬本牧集(1)患者诊断确认：所有寻常型银屑病患者均经临床和缀织病理确诊。收集47例病饿耱友损暂份，岁卜溺静脉盘20份，并扶羚髑静脉血中分离斑清20份。(2)献血员和正常对照：采集正常献血员外周静脉斑20份，并从中分离盘清嬲静。收集整形外辩手术切除昀歪紫皮肤34份。2．皮损中TNF—Ct

6、及其受体TNFR—I和’州FR一Ⅱ的检测分爨黻抗入TNF—a、TNFR—l稀TNFR—II为一抗，采掰免疫组织化学方法对皮攒和麦损边缘外混正常皮肤表皮及真瘦内单一核细胞TNF—Ot及其受体TNFR—I和TNFR一Ⅱ的表达进行研究。3。熙ELISA法捡溅蛊演孛TNF一0t及其受体孵含量采用人TNF一仪ELISA试剂盒检测银屑瘸患者血滂中TNF一0C，謦{l用人sTNFRELISA试粼盒检测锻屑病患者斑清中侧举驭一I和sTNFR一Ⅱ。4。表皮RNA提教、RNA纯度褪浓嶷测定及其浓度豹谴定(1)真皮表皮分离：用EDTA—Na,缓冲液剥离表皮。·2·(2)以目前通用的TRIZOL方法提取正常人表皮和寻

7、常型银屑病患者皮损表皮总RNA。(3)提取的总RNA用紫外分光光度计测定260nm和280nm的光密度(、OD)，并根据此OD值计算RNA的浓度和纯度，用DEPC水调定RNA浓度至0．stag／一。5．逆转录合成cDNA遵循Promega试剂盒的操作要求，取2止(含1trgRNA)RNA稀释液进行逆转录。经变性和逆转录过程之后，将产物eDNA按1：4稀释并分装，一20℃冻存，以供PCR使用。6．引