转AIIA基因魔芋的软腐病抗性及魔芋内生菌产生抑菌蛋白的组成分析

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1、华中农业大学硕士学位论文转aiiA基因魔芋的软腐病抗性及魔芋内生菌产生抑菌蛋白的组成分析姓名：班慧芳申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：孙明20090601转aiiA基冈魔芋的软腐病抗性及魔芋内生菌产生抑菌蛋白的组成分析摘要本论文共包括两部分工作，一部分是对转aiiA基因魔芋(Amorphophallus勋njac)的抗病性检测；另一部分是对枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)BSn5中新型抑菌蛋白APn5进行了双向电泳以及质谱分析，另外，为了寻找APn5的编码基因，依据质谱分析的结果，开展了一部分基因敲

2、除的工作。1．魔芋是我国重要的经济作物之一，广泛应用于食品、医药、化工、建筑等领域。但是，魔芋的生产受到软腐病的严重威胁，其致病菌是胡萝卜软腐欧文氏菌。该茵是一种革兰氏阴性细菌，具有广泛的寄主范围，通过细菌群体感应调节系统(Quorumsensingsystem，QSsystem)来调节其致病相关基因的表达。研究发现在芽胞杆菌中广泛存在一种aiiA基因，该基因编码一种可以降解QS系统中信号分子酰基高丝氨酸环内酯(Acyl—homoserinelactone，AHL)的酶，可通过干扰病原菌的QS系统而减弱其致病性。本研究中对

3、34株转aiiA基因的魔芋植株进行温室盆栽种植，同时进行了魔芋抗软腐病的离体抗病性检测，结果表明魔芋在温室条件下长势良好，无病虫害的发生。抗病实验中取不同转基因魔芋植株叶片，分别接种2×105，2×107，2×109cfu胡萝卜软腐欧文氏菌SCGl，侵染96h后观察发病情况，转aiiA基因植株叶片发病症状较对照植株均明显减轻，发病面积明显减小，该抗病实验持续进行了两年，均得到相同的实验结果，表明转aiiA基因魔芋植株获得了对软腐病的显著抗性，且aiiA基因在魔芋基因组中是稳定和可遗传的。2．在进行魔芋转基因的过程中，从愈伤

4、组织中分离到一株对魔芋软腐病菌有抑菌活性的内生菌枯草芽胞杆菌BSn5。研究表明BSn5的抑菌活性是由其胞外蛋白Apn5所产生的，该蛋白对胡萝卜软腐欧文氏菌具有很好的抑菌活性。为了研究APn5蛋白的性质及其编码基因，利用双向电泳技术对经过30％饱和度(NH4)2S04沉淀、脱盐、超滤管纯化的APn5蛋白进行分析，并采用基质协助激光解吸附离子化．飞行时间质谱(MALDI．TOF．MS)对所有得到的蛋白点进行了肽质量指纹图谱分析鉴定，Mascot软件搜索NCBInr数据库鉴定蛋白质。300lxg蛋白经过双向凝胶电泳及考马斯亮蓝染

5、色后可以检测出13个蛋白点，这些蛋白点主要集中在分子质量10—30kDa区域，等电点分布于4—5．5之间。MALDI．TOF．MS鉴定了11个蛋白点。在这些蛋白中，有4个蛋白点都和鞭毛蛋白表现出相似性，其他点在数据库中比对的Mascot华中农业大学硕士学位论文2009分值太低，因而结果不可信。为了证明APn5这种抑菌物质与鞭毛蛋白之间的关系，．拟通过双交换的方法敲除BSn5中的鞭毛基因，以检测鞭毛蛋白基因缺失后对APn5的产量、性质、抑菌活性等方面的影响。本研究构建了用于进行双交换的载体pUCl9一hag：：Erm。BSn

6、5的转化和基因敲除还有待继续进行。关键词：抗病性；枯草芽胞杆菌；抑菌物质；鞭毛；基因敲除II转aiiA基因魔芋的软腐病抗性及魔芋内生菌产生抑菌蛋白的组成分析AbstractTheresearchincludstwoparts：oneisidentificationofresistancetosoftrotofaiiAgenetransformedAmorphophalluskonjac；theotheristwo-dimensionalelectrophoresisandMALDI·-TOF--MSanalysisofan

7、ovelantibioticproteinApn5producedbyBacillussubtilisBSn5．InordertosearchfortheencodinggeneofApn5，somejobforgeneknock．outhasbeendone．1．Amorphophallus勋njacisoneoftheimportanteconomiccropsinourcountry,whichiswidelyusedinfood，medical，chemicalandconstructionindustry．But

8、itsproductionisthreatenedseriouslybysoftrotcausedbyErwinacarotovorasubsp．carotovora．Thispathogenisagram—negativebacterialwithwidehost．Theexpressionofits