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1、内生真菌的抑菌性研究1材料及设备1.1分离内生菌所用树木及指示菌柏树、树枝、树皮；指示菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（1）分离培养基:树木浸汁20mL,琼脂20g,蒸憎水980mL,pH自然;（2）真菌分离培养基：酵母膏吨，树木浸汁20mL,琼脂20g,链霉素终浓度30.Ol^g/mL,蒸傭水980mL,pH4・&（3）牛肉膏蛋白腺培养基：牛肉#3.0g,蛋口月东lO.Og,氯化钠5.0g,蒸馅水1000ml,pH7.0-7.2,固体培养基加入2%的琼脂;（4）半固体牛肉膏蛋白腺培养基：牛肉膏蛋白腺液体培养基屮加入0.6%琼脂，加热溶解，分装小瓶,每瓶25mL；（5）査氏培养基:蔗糖30g,Na
2、N032.0g,KC10.5g,MgSO.O.5g,FeSO.O.Olg,K2HPO4l・0g,蒸憾水1000ml,pH自然，固体培养基加入2%的琼脂;（6）半固体查氏培养基：查氏液体培养基中加入0.6%的琼脂，加热溶解,分装小瓶，每瓶25mL；（7）水琼脂培养基：琼脂20g,蒸憾水1000ml,pH自然;以上培养基在1.05kg/cm2,121°C,20min高压蒸汽灭菌后备用。1.3主要仪器设备电子天平、全自动灭菌锅、柜式恒温冷冻摇床超净台、电热恒温培养箱、生化培养箱、保鲜柜低速离心机、光学显微镜、电热恒温鼓风干燥箱2.试验方法2.1内生真菌的分离用灭菌解剖刀分别取主干和侧枝的树皮、韧皮部
3、和木质部,切成薄层小块（两端均需有切口），约lcmX1.5cm大小，，用自来水将表面清洗干净晾干，无菌操作置于75%乙醇消毒3〜5min,后用无菌水冲洗3〜4次，0.1%升汞消毒30s,再用75%乙醇消毒lmin,无菌水冲洗3〜4次，将横截面切段接入已倒好的分离培养基上，将培养皿置于28°C培养箱屮倒置培养3〜5d。大约3〜5d后在分离培养基上长出菌，然后三区划线法把菌接入真菌分离培养基，分离出单菌落。2.2内生真菌的纯化接利
4、物培养2〜3d后，其边缘长出菌丝，用接种针挑取切口处新长出的菌丝,及时转接至查氏培养基上培养，待菌落出现后，按以下方法逐步纯化，对菌株编号后，传至查氏斜而培养基上，于2
5、8°C培养箱屮培养3〜4d,然后放入4°C冰箱保存。2.2.1平板划线分离法先用灭菌的接种环挑取少许菌，在琼脂平板上划Z线至平板三分之一处，此为一区，一区要密些，然后灼烧接种环，将接种环冷却后，划二区，划线要与一区交叉一次，同理划三区与二区交叉一次。三区要划的分散些，以便容易分离岀单菌落。2.2.2稀释涂布平板法(1)倒平板将查氏固体培养基加热溶化，待冷至55〜60°C时，倒平板。(2)制备菌悬液将待测菌接入装有10mL无菌水的试管中，振摇约20min,用一支ImL无菌吸管吸取1皿菌液，加入到盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀。然后用另一无菌移液枪从此试管吸取ImL混合液加入另一瓶盛有9mL无
6、菌水的试管屮，混合均匀。以此类推制成1010_10'、10"、1010_101(T不同浓度的菌悬液。(1)涂布将上述培养基的平板底面分别标记上1010'1010'8四种稀释梯度，然后用无菌移液枪分别由101010108四管屮吸取0.ImL菌液对号放入相应的平板中，用无菌玻璃涂布棒轻轻涂匀，静置5〜lOmino(2)培养将平板倒置于28°C培养箱中，培养24〜48h。（5）挑菌落将培养后长出单个菌落的平板分别调取少许菌体接种到查氏斜面上，28°C培养箱屮培养3〜4d,JC冰箱保藏。2.2.3摇瓶培养无菌操作条件下，将分离出的内生真菌用接种环接种于盛冇200mL查氏液体培养基
7、的500mL三角瓶内，每菌株1瓶，在28°C,140r/min的摇床上振荡培养7〜lid。2.2.4纸片扩散法法抑菌实验2.2.4.1培养基（1）查氏半固体培养基：用于培养真菌；（2）牛肉膏蛋白豚半固体培养基：用于培养细菌。2.2.4.2滤纸片的制作（1）含内生真菌发酵液中的抑菌物质的滤纸片制作：用打孔器将滤纸冲成6mm的圆形纸片将纸片置于不同内生真菌发酵液屮充分润湿。（纸片屮的抑菌药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的指示菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的
8、抑菌圈。）2.2.4.3指示菌悬液的制备预先把指示菌在室温下活化2h,然后在超净台上用接种环刮取两环菌种置于30mL无菌水屮，摇匀，制成菌悬液。2.2.4.4指示菌培养基的制备在无菌条件下，用移液枪吸取lmL菌悬液加入到盛有25mL半固体培养基的小三角瓶屮，其屮细菌指示菌加入到牛肉膏蛋白月东半固体培养基，真菌指示菌加入到查氏半固体培养基，混匀备用。2.2.4.5发酵液的制备将摇瓶培养的真菌发酵液，
