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《抗软腐病基因 aiia 在魔芋块茎组织中特异性表达研究(可编辑)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、抗软腐病基因aiiA在魔芋块茎组织中特异性表达研究分类号Q7密级UDC硕士学位论文抗软腐病基因aiiA在魔芋块茎组织中特异性表达的研究学位申请人:廖甜甜学科专业:生物化学与分子生物学指导教师:乐超银教授二○一二年五月Classifiedcode:Q7Confidentialdegree:UDC:ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceSpecificexpressionofsoftrotdiseaseresistantgeneaiiAintubersofA
2、morphophalluskonjacGraduateStudent:LiaoTiantianMajor:BiochemistryandMolecularbiologySupervisor:Prof.YueChaoyinChinaThreeGorgesUniversityYichang,443002,//.naMay,2012三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果,除文中已经注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方
3、式标明,本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名:日期:I三峡大学硕士学位论文摘要魔芋是多年生单子叶草本植物,其变态茎富含的葡甘聚糖具有广泛的应用价值。目前魔芋软腐病成为魔芋产业发展的瓶颈,利用基因工程技术获取抗软腐病魔芋新品种成为魔芋软腐病生物防治的有效手段。本研究构建了含有块茎特异性启动子patatin和抗软腐病基因aiiA的植物表达载体,并通过农杆菌介导法遗传转化魔芋,拟以此途径获取抗软腐病魔芋植株。主要包括以下研究内容:以pET28a为载体质粒,根据GenBank登录号GU339170.1的aiiA基因序列设计引物,以苏云金芽孢杆菌218基因组DNA为模板扩增克隆
4、aiiA基因,构建重组原核表达载体pET28a-aiiA,并利用热激法成功转化大肠杆菌表达菌株E.coliBL21DE3。在37℃下培养至菌体OD至0.4,添加IPTG0.6mmol/L并在20℃下分别诱导培养60012h、16h、20h、24h后,超声波破碎菌体提取粗蛋白,经SDS-PAGE检测,可见28KD大小的目的基因表达产物。经抗魔芋软腐病病原菌活性检测,结果显示蛋白粗提液对魔芋软腐病病原菌生长有明显的抑制作用。以花魔芋小球茎和根状茎为外植体,以MS培养基为基本培养基,添加不同激素诱导和分化培养,将诱导的魔芋丛生芽切成单株后进行生根培养。本实验中采用愈伤诱导培养基为MS+6-BA1
5、.0mg/L+NAA1.0mg/L,新鲜材料接种后50-60天,形成的愈伤组织可用于后续的遗传转化。以pBI121为载体质粒,根据GenBank登录号GQ352473.1的patatinClassⅠ基因启动子序列设计引物,从马铃薯幼嫩球茎基因组DNA中克隆块茎特异性启动子patatin。设计含有BamHⅠ单酶切位点的特异引物,从苏云金芽孢杆菌218中克隆aiiA基因。构建含aiiA基因的抗软腐病植物表达载体pBI121-patatin-35S-aiiA和pBI121-patatin-aiiA。利用冻融法,将重组植物表达载体转化到农杆菌LBA4404中,并通过农杆菌介导法,对魔芋小球茎和根状
6、茎诱导形成的愈伤组织进行遗传转化。采用本课题组已建立的魔芋遗传转化体系,用含有重组植物表达载体pBI121-patatin-aiiA和pBI121-patatin-35S-aiiA的农杆菌遗传分别转化魔芋愈伤组织,将共培养后的愈伤转接至分化培养基筛选抗性愈伤。对筛选分化出的pBI121-patatin-aiiA转化植株进行GUS染色,仅在球茎中可见蓝色斑点,aiiA基因在球茎中特异性表达。对筛选分化出的pBI121-patatin-35S-aiiA转化植株进行GUS染色,PCR检测,PCR-Southern杂交和Southern杂交检测。GUS染色结果显示,叶柄和球茎中可见蓝色斑点,PCR
7、检测,PCR-Southern杂交和Southern杂交结果证明aiiA基因已经整合到魔芋基因组中。关键词:魔芋;软腐病;aiiA基因;块茎组织特异性表达II三峡大学硕士学位论文AbstractThemainsubstancecompoundofAmorphophalluskonjacisglucomannan,whichhasbeenwidelyusedinhealthproductsandbiomaterials.H
