人胚胎脑海马区神经干细胞的体外培养及异种移植

《人胚胎脑海马区神经干细胞的体外培养及异种移植》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、徐州医学院硕士学位论文人胚胎脑海马区神经干细胞的体外培养及异种移植姓名：姚瑞芹申请学位级别：硕士专业：神经生物学指导教师：徐铁军;张凤真20030401!苎塑矍人胚胎脑海马区神经干细胞的体外培养及异种移植研究生：姚瑞芹导师：徐铁军副教授张凤真教授中文摘要目的：从人胚胎脑海马分离、扩增、克隆神经干细胞(neuralstemcellsNSCsj，探索其体外生长的最佳条件，比较不同时间点NSCs分化为神经元和胶质细胞的比例；通过神经上皮干细胞蛋白(Nestin)表达的变化，分析成年大鼠纹状体海人藻酸(KA)损伤后的病理变化及可能机制：异种移植体外培养的人NSCs(HNSCs)，初步探索KA

2、损伤信号对异种移植的HNSCs存活的影响。方法：、l、原代细胞培养取材于胎龄8．12周正常药物引产的人胚胎脑海马。①用于培养的组织一组用0。25％的胰蛋白酶消化，另一组用机械分离法分离，台盼蓝染色鉴定活细胞比例，然后均以2×106个细胞／ml密度接种到含20ng／mlh-EGF、10ng／mlh-bFGF和10ng／mlh-LIF基础培养液中，倒置显微镜观察。②为观察不同生长因子对细胞生长的影响，按基础培养液中生长因子的不同将培养液分为：EOF组、FGF组、EOF+FGF组、EGF+h—LIF组、FGF+h-LIF组、EGF+FGF+h．LIF组、FBS组。将机械分离的单细胞悬液均以

3、2×106个细胞／ml接种到上述组别，倒置显微镜观察。③原代培养形成的细胞球机械分离成单细胞悬液，按I：2的比例传代。④原代或传代细胞球机械分离成单细胞悬液，用有限稀释法进行单克隆培养。⑤为进行分化研究，将细胞球种在铺有多聚鸟氨酸的培养板中，培养液为含有I％FBS的基础培养液：12h和4d后用RNA．结合蛋白(Musashil)多克隆抗体行免疫细胞化学染色鉴定NSCs(ABC法)，2d、5d、7d、14d、23d后用B·IIITubulin、GFAP单克隆抗体和GalC多克隆抗体行免疫细胞化学染色(ABC法)，计数分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的比例。2、为研究KA损伤后纹

4、状体Nestin表达的变化及化学损伤信号对异种移植的HNSCs存活的影响，本研究采用体重为220+209的成年健康sD大鼠。①正常对照组(NC，n=l×4)，生理盐水组中文摘耍(NS，n=4X4)，KA损伤组(KA，n=4×4，纹状体内注射0．5ul1mg／ml的KA)；在KA注射后1d、3d、7d、14d，各组均用O．4％戊巴比妥钠麻醉，4％多聚甲醛灌注固定、制作连续冠状冰冻切片，片厚30urn，分别行HE染色及Nestin的免疫组织化学反应。②用于细胞移植的动物分四组：正常纹状体和侧脑室移植组，纹状体KA损伤后的纹状体和侧脑室移植组(各组n=5)；移植前48h，用luMBrdU标

5、记HNSCs，移植后6w，用BrdU抗体检测移植后的HNScs是否存活[参照方法2①]。结果：1、①胰蛋白酶消化组和机械分离组分离到的活细胞分别占各自细胞总数的48．2％和61．7％；7d后，两组均形成许多直径从几十到几百个微米不等的细胞球，但机械分离组的细胞球数目明显多于胰蛋白酶消化组。@在含不同生长因子的培养液中，原代培养6h时，各组细胞情形区别不大。培养24h后，EGF+FGF组和EGF+FGF+h-LIF组形成大量的小细胞簇，其它组细胞簇数目较少。72h后，EGF+FGF组和EGF+FGF+h．LIF组细胞簇体积增大，数目仍然最多；FBS组细胞簇几乎全部贴壁，细胞伸出突起；F

6、GF组和EGF组的细胞簇开始“解体”，死亡细胞分别为40～50％和70～80％。7d后，EGF+FGF组和EGF+FGF+h．LIF组悬浮细胞球在数目上无显著差异；FGE+h．LIF组和EGF+h．LIF组有较少的悬浮细胞球；FBS组细胞分化，细胞间的突起交错相连呈“蜘蛛网”状；FGF组偶见小细胞球；EGF组未见细胞球。③传代细胞能形成与原代相似的细胞球，并可继续传代培养。④HNSCs的单克隆形成率非常低，约0．5～1％。⑤Musashil免疫细胞化学显示：诱导分化12h时细胞球中绝大部分细胞为Musashil+，分化4d时仍有少数细胞为Musashil+。且．111．tubulin

7、、GFAP和GalC免疫细胞化学显示：第2d时有少量的13-III-tubulin+和GFAP+细胞，无GalC+细胞：第7d时且一Ill—tubulin+细胞所占比例达最高，以后开始下降，而OFAP+细胞所占比例在第2-23d内逐渐增加；随分化时间延长，能检测到极少量的GalC+细胞。2、①HE染色，KA组在损伤后第3d，纹状体的损伤区细胞密集，层次紊乱，胞核深染，白质被增生的细胞占据；第7d时注射点周围损伤区域扩大，增生的细胞增加，损伤侧侧脑室明显扩大