人胚胎生殖细胞体外培养条件的优化及细胞移植的实验研究

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1、人胚胎生殖细胞体外培养条件的优化及细胞移植的实验研究：李芳，陈永珍，张于娟，李金【摘要】目的：优化人胚胎生殖细胞（EG细胞）的体外培养体系，并将生长状态良好的传代的人EG细胞移植用于大鼠心肌梗死模型的治疗，探讨人胚胎生殖细胞进行异种移植对大鼠心肌梗死的治疗机制。方法：取5~10周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜，用添加和不添加细胞因子的两种培养体系对比进行组织块原代及传代培养，选取生长情况良好的传至第4代的人EG细胞，移植到急性心肌梗死大鼠的梗死心肌周围，分别于移植后1天、1、2、4周处死大鼠，以鼠抗人细

2、胞核抗体MAB1281作为示踪剂[1]，通过免疫组化方法检测移植细胞的分布。结果：在培养液中添加LIF和b-FGF后原代及传代培养的人EG细胞生长旺盛，形成集落更早，传到第4代形成的集落体积变化不大；移植组人EG细胞在移植后1天、1周、2周、4周均可以在心梗区域观察到MAB1281阳性细胞。结论：添加LIF和b-FGF的培养体系是更高效的人EG细胞培养体系。人EG细胞可异种移植，人EG细胞在大鼠心肌梗死处由心外膜层逐渐向心肌层迁移。【关键词】人胚胎生殖细胞；白血病抑制因子；碱性成纤维细胞生长因子；心

3、肌梗死；细胞移植[Abstract]Objective:TooptimizetheculturesystemofhEGcsinvitro,selectthehEGcsfromsubculturetotransplantdirectlytotheratinfarctedmyocardiumandobservethetherapeuticmechanismoftheirheterotransplantationinthetreatmentfortheratmyocardialinfarction.Met

4、hods:ThehEGcsfromthegonadalridgesanddorsalmesenteriesofhumanembryosaged5-10ediumtoobservetheirgrospassage4yocardium.Theratsyocardialinfarctionplantation.Amonoclonalantibodyspecificforhumancellularnuclei(MAB1281)igrationanddistributionoftransplantedcell

5、s.Results:hEGcsgreediumaddedaintainedinthepassage4.Conclusions:Themediumaddedigratefromtheepicardiumtothemyocardiumanddifferentiateintocardiacmyocytesgradually.[Keyyocardiuminfarction;Celltransplantation随着人们物质生活水平的提高，饮食结构的变化，以及我国人口的老龄化，急性心肌梗死已经成为危害国民健康

6、的主要疾病之一。目前尚无确切证据表明心肌本身存在特异的干细胞，成熟心肌细胞属于终末分化细胞，丧失再生能力，仅仅局限于存活部分的心肌,不能有效修复心肌组织。因此心肌梗死后坏死的心肌只能由成纤维细胞取代，形成无收缩功能的瘢痕组织，最终导致心力衰竭而威胁生命。因此，寻求一种更新更好的治疗手段，成为临床的当务之急。用干细胞作为种子细胞运用细胞移植的方法，进行急性心肌梗死的治疗，目前越来越受到研究人员的关注，早在1996年Klug等已开始了ESCs在体心肌细胞成形术研究[2]。人胚胎生殖细胞（embryoni

7、cgermcells,EG细胞）是源于人原始生殖细胞（primordialgermcells,PGCs）的一类胚胎干细胞。与于胚泡内细胞群的ES细胞相似，同样具有自我更新能力，多向分化潜能及无限增殖能力。目前还没有人EG细胞移植治疗心肌梗死的报道。因此本实验进行了体外培养的人胚胎生殖细胞植入大鼠梗死心肌部位的研究，希望最终能为心肌梗死治疗提供新的思路，为干细胞的临床应用奠定基础。1材料与方法1.1主要试剂DMEM培养基（GIBCO/BRL、高糖）、胎牛血清（fetalcalfserum,FCS,Hy

8、clone）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF,RD公司）、白血病抑制因子（LIF，RD公司）、培养液A：DMEM液（高糖）+15%胎牛血清+0.1mol/Lβ-巯基乙醇+2mmol/L谷氨酰胺+100U/ml青霉素+100U/L链霉素、培养液B：DMEM液（高糖）+15%胎牛血清+0.1mol/Lβ-巯基乙醇+2mmol/L谷氨酰胺+100U/ml青霉素+100U/L链霉素+1000U/mlhLIF+1ng/mlbFGF[30]、胰蛋白酶（Sigma）及EDTA、M