WD基因全外显子序列分析及胚肝细胞移植治疗Wilson病的实验研究

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1、中山大学博士学位论文WD基因全外显子序列分析及胚肝细胞移植治疗Wilson病的实验研究姓名：石铸申请学位级别：博士专业：神经病学指导教师：梁秀龄2003.5.6鲨型媛垫星塑羔垒窦缀塑型鳖量篓垒黧芝塑垄壁墼i黧—————篷W1)基因全外显子序列分堑殿胚肝细胞移植治疗W1)的实验研究鼎__·_—___r专业媾士研究生导辩神缀病学蠢铸粱秀龄攘要，fWilson病(Wilsondisease，WD)，又称为肝豆状核变性(hepatolenticularLdegeneration，HLD)，是一种以铜代谢障碍为特征的常染

2、色体隐性遗传病。瘸理生瑾辊镁楚由于盘渣镄蘸蛋鑫合成躐少亵疆遂蓑}锈簿薅，荨；起镄痣子在蒡手、簸组织尤其魁旗底节区、肾、角膜等部位沉积，临床主要表现为好发于青少年、戚清铜蓝蛋白低下、肝硬化、锥体外系癜状、l肾功能损害、角膜K．F环等。本瘸于1912年凌荚嚣学者KinnierWilson簌箕薅±论文孛营先详尽攥滚，并嚣魏褥名。世界范围内的患病率为I／3万活婴，发病率15～30／100万。总体来说，欧美备国发病率较低，东方国家如印度、日本镣发病率较离，我国尚无大规模的流行瘸学报告，缀壤据众多姿褥攘潮本病奁我霹懿发病率

3、鬣著毫予欧美。弹指90年，Wilson病研究取得了巨大进步。尤其是1993年Wilson病的致病基因——ATP7B被克隆后的十年中，伴随着人类基因组计划的飞速发展和分子生物掌、缓缒生貔学技术懿不数滋步，Wilson瘸熬磅究髫鬻冀雾。器蔻奁突交基因检测、爱白质水平的发病机制研究、治疗策略包括转基因以及细胞治疗几方面取得了较大进展。一．wD基网分子发病机制的研究1993年，WD基因被几个研究小缀分别独立兜隆，标志着WD研究进入分子耋貔学水平翡耨狯段。寤予壹接检测突变基强鹣鏊函诊繇方法怒擎基嚣遗梭瘸最直接、最准确的诊

4、断方法，并为症状前患者的早期检出提供了可能，因此圈内外众多学者致力于WD旗因的突变检测工作，并希冀了解WD蒺因突变昀特镊。逶遥鑫家学者豹荚丽努力，截壹裂2002年i2蜀，髓界各圭

5、垂共报道详8基霾突交丝型咝塑型型蟹墅塑丝垂堂丝型塑————卫类型225种，其中碱基置换(包括错义突变、无义突变)144种(64％)、缺失突变52种(23％)、、插入突变13种(5．7％)，这些突变均位于各外显子序列内，另有14种突变位于各剪切位点和调控元件(6．27％)。在这些复杂的基因突变形式中，仅有极少数突变频率较高，而绝大多数是

6、稀有的突变位点。例如，H1069Q突变为欧美各种族WD基因的高频突变位点，而亚洲人群中未见报道；R778L突变为东方人常见的突变热区，欧美人群则罕见。WD基因所编码的是一种重金属转运P型ATP酶——ATP7B。蛋白结构主要包括铜离子结合区(N端)、8个跨膜区、一个磷酸酶区和ATP结合区(C端)等。当细胞内铜浓度升高时，N端的6个铜离子结合位点全部被上游铜伴侣蛋白HAHl传递而来的铜离子占据，引起构像的改变，ATP7B蛋白N端一个潜在的磷酸化位点被磷酸化激活，ATP7B与高尔基体膜解离，重定位于胞浆内的分泌囊泡，

7、借助于ATP水解的能量将铜离子运输到分泌囊泡，其后经肝细胞的胆管面排入胆小管；当细胞内的铜浓度降低时，由于部分铜离子结合位点空置引起这个磷酸化位点被重新水解，构像再次变化，ATP7B又回到高尔基体光面，利用ATP水解的能量将铜离子转移致前铜蓝蛋白(Proceruloplasmin)上负责全铜蓝蛋白的合成。WD基因突变使得编码蛋白的功能部分或全部丧失时，相应引起肝铜排泄障碍、铜蓝蛋白水平低下，导致WD发病。与WD基因突变特点相一致，WD的临床表现也极为复杂。许多学者曾试图将基因型与临床表型进行相关分析，但迄今为止

8、还没有肯定的结论。另外WD基因全长包括21个外显子，cDNA长达4．2kb，仅进行个别基因结构的的突变检测有可能造成漏诊，也无法反映WD基因突变的全貌，因此有必要在WD基因全部编码序列的尺度上进行全面分析，并探讨WD基因突变的规律及其与表现型的关系。二．WD新的治疗手段的研究如不及时治疗，Wilson病是致死性疾病。针对铜在体内沉积的病理生理学特点，如能在疾病的早期进行有效的驱铜治疗，则可以有效的阻止铜的继续沉积，并使已经沉积的铜排除体外，使患者获得满意的生活质量。青霉胺是目前WD治疗最主要的药物，但由于(1)

9、少数病人在服用青霉胺后有神经系统症状加重的现象，极少数甚至呈不可逆的损害；(2)部分病人不能耐受大剂量的青霉胺：II塑墅墼丝呈塑翌型墼墅塑墅垡楚塑丝!墅趁—楚薹(3)药物治疗必须终身维持，病人依从性差等缺点，必须寻找新的更有效的治疗手段。簇位翳移植不仅可跌为患畿提供一个健康器脏，雨量毅翳功能恢复聪可以不同程度的改善患者原有的铜代谢障碍，理论上无需再服用排铜药物治疗。但OLT手术的创伤和