β淀粉样蛋白2535对大鼠神经干细胞的毒性和雌激素的保护作用

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1、郑州大学硕士学位论文β淀粉样蛋白25-35对大鼠神经干细胞的毒性和雌激素的保护作用姓名：李开荣申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：崔景彬20030501郑州大学2003年硕士研究生毕业沦文AB25—35对胚胎神经可·细胞的毒性和雌激素的保护作用D淀粉样蛋白25—35对大鼠神经干细胞的毒性和雌激素的保护作用研究生李开荣导师崔景彬郑州大学基础医学院生物化学教研室河南郑州450052摘要神经干细胞是一类具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞潜能，并能自我增殖的多能干细胞。神经干细胞研究为治疗神经系统疾

2、病开拓了广阔的前景，但它要成功应用于临床，则要取决于其定向诱导分化和疾病局部微环境对神经干细胞的影响的研究。表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)．}II碱性成纤维生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)是研究最为广泛、深入的神经干细胞增殖分化诱导因子，除了具有促增殖作用外，它们在不同培养条件下还能诱导神经干细胞向终末方向分化。雌激素、维甲酸(retinoicacid，RA)是神经系统正常发育所必须的两种因子，提示它们在神经干细胞分化诱导方面可能也发挥着重

3、要作用。B淀粉样蛋白(AmyloidPeptidy,AB)是淀粉样蛋白前体蛋白(amyloidprecusorprotein。APP)异常代谢产生的含有39--43个氨基酸残基的疏水肽，可聚合成不溶的纤维形式或不定型颗粒状结构，导致各种毒性反应，在阿尔茨海默病(Alzheimer’SDisease，AD)发病中起着至关重要的作用。A口的毒性也可为许多因子如雌激素等所拮抗，因此它们在AD的治疗中发挥着重要作用。本实验从胚胎大鼠脑中分离出神经干细胞，进行体外培养，随后观察了EGF、bFGF、17—13雌二醇、全反式维甲酸(

4、all-transretinoicacid，ATRA)分别对神经干细胞分化的诱导作用；另外，用A§的毒性片段A825—35干预神经干细胞，并加入雌激素的活性形式17一B雌二醇，观察AB对神经干细胞的毒性和雌激素的保护作用，为神经干细胞治疗AD进行了积极的探索。材料与方法从胎龄14天的SD大鼠全脑中分离出神经干细胞，以EGF和bFGF(各20ng／m1)#J有丝分裂原，无血清体外培养。随后进行以下实验：——塑!!!!查堂型坐!堡主要圣兰竺些丝兰!!!!：墅型壁堕塑丝三塑些鲤妻丝塑些堂童塑堡芝生旦1．神经干细胞鉴定及增殖能

5、力检测培养8天后，取部分细胞，．5．嗅．2一脱氧尿苷(5一Bromo一2一deoxy-uridine，Brdu)标记，2天后进行nestin及Brdu免疫细胞化学染色，鉴定神经干细胞及其增殖能力。2．神经干细胞诱导分化培养14天后，取部分细胞加入终浓度为10％的胎牛血清，分为五组，再分别加入以下因子：对照组；EGF组，加入EGF(20ng／m1)：bFGF组，加入bFGF(20ng／m1)；雌激素组，加入17--B雌二醇(10～mol／L)：维甲酸组，加入ATRA(1umol／L)。继续培养4天，随后进行MAP2、GF

6、AP免疫细胞化学染色分别观察诱导分化结果。3．体外培养14天后，取部分细胞，加入不含bFGF仅含EGF(20ng／m1)的无血清培养基，分为三组：对照组；AB25．35毒性组加入20umol／的凝聚态AB25．35：雌激素保护组同时加入20umol／的凝聚态AB25．35和10。mol／L17—13雌二醇。以上三组细胞继续培养，并于第6、12、24、36、48小时台盼兰染色，计数细胞死亡率。48小时后，各组细胞进行以下实验：TUNEL法凋亡形态学检测；RT-PCR检测bcl．2、bax的mRNA表达；BrdU、GFAP

7、、MAP2免疫细胞化学染色检测神经干细胞增殖分化。实验结果1．神经干细胞鉴定及增殖能力检测培养十天后，所有细胞均为nestin阳性细胞；BrdU免疫细胞化学染色可见阳性细胞存在。2．神经干细胞诱导分化对照组几乎无GFAP、MAP2阳性细胞，而EGF、bFGF、雌激素、ATRA诱导组均可见GFAP、MAP2染色阳性的分化细胞。此外，各诱导因子作用组GFAP、MAP2染色阳性细胞率无明显差别。3．AB25—35对神经干细胞的毒性及雌激素的保护作用3．1A1325—35和A1325—35+雌激素作用后神经干细胞死亡率变化。加

8、入AB25--35后，细胞死亡率明显上升，且呈时间倚赖性。12小时至36小时之间，死亡率上升最快；36--48小时，死亡率几乎不再上升，稳定在60％左右。联合加入17一B雌二醇后，细胞死亡率显著降低。3．2AB25—35和AB25—35+雌激素作用后凋亡形态学检测对照组几乎未见凋亡细胞；雌激素保护组可见凋亡细胞，但比例少于A13毒