万古霉素高产菌种的推理选育及发酵工艺优化

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1、浙江大学硕士学位论文万古霉素高产菌种的推理选育及发酵工艺优化姓名：阮丽军申请学位级别：硕士专业：生物化学工程指导教师：岑沛霖2002.11.1浙江大学硕卜学位论史摘要根据万古霉索的生物合成途径和代谢调节机理，对万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)进行推理选育，旨在获得高单位菌株。首先用正交试验法优化万古霉素的发酵培养基，与原培养基相比，优化后的发酵培养基能使出发菌株A．orientalis1-6的发酵单位提高21．5％。在此基础上，以A．orientalis1-6为出发菌株，经过3次紫外线诱变，分别筛选0．5％乙酸钠耐性突变株、0．7％磷酸

2、氢二钠耐性突变株和万古霉素耐性突变株，并结合自然分离纯化，最终获得高产突变株A．orientalis7-9，其摇瓶发酵效价达4800u／ml，较出发菌株生产能力提高98％。传代试验表明，该变株的高产性能遗传性较稳定。通过发酵培养基成份的改进，A，orientalis7-9的摇瓶发酵单位进一步提高了14．3％。从万古霉素的摇瓶发酵着手，考察了无机盐、温度、种龄、溶氧、剪切力和可能的前体物质对万古霉素发酵的影响，结果表明：KH2P04和KN03的最适加量分别为O．01％、0．4％；万古霉素产生菌的最适产物合成温度为25℃：万古霉素的发酵对溶氧要求高，而对剪切力不太敏感。采用优化的发酵配

3、方和发酵条件，并在发酵进行至48h补入0．2％乙酸钠，可明显提高效价，其摇瓶效价达6430u／ml。]以摇瓶发酵实验为基础，进行了万古霉素发酵由摇瓶到15L发酵罐的放大，15L发酵罐万古霉素发酵单位可达4996u／ml。户文，关键词力．古霉素白÷，宁撤无枝酸菌十肇镬选育乙酸钠耐性变株磷酸热耐受变株力．古霉爹《硅变株蜓‘浙江人学坝Ij学位论立ABSTRACTBasedonthebiosyntheticpathwayandmetabolicregulation，arationalselectionprocedurewasperformedtoobtainanewvancomycinhi

4、gh-producingstrainAmycolatopsisorientalis．Atfirst，themostsuitableproductionmediumforrationalseletionoftheparentstrainA．orientalis1-6wasestablishedbyorthonormaldesignmethod．Withtheoptimalmedium，theproductivityofA．orientalis1-6wasraised21．5％．Onthisbasis．arationalscreeningwasadoptedtoselectastrai

5、nwhichcouldgrowwellonthemediumwithhighconcentrationof0．5％NaAc，0．7％Na2HP04and1000u／mlvancomycin．Byabovemethods，ahigh-producingstrain7-9wasobtained．Theproductivityreaches4800u／ml，whichisincreasedby98％incomparisonwiththatoftheparentstrain1-6．Subculturetestindicatedthatthehereditarycharacterofhigh

6、productivityofA．orientalis7-9wasstable．TheproductivityofA．orientalis7-9inshakeflaskswasraised14．3％furtherafteroptimizationofthefermentationmedium．Theeffectsofinorganicsalts，temperature，seedage，dissolvedoxygen，shearingstrengthandprecursorswerestudiedinshakeflaske．TheoptimalconcentrationofKH2P04

7、andKN03was0．01％．0．4％，respectively．Inthecourseofvancomycinfermentation．theoptimaltemperatureforvancomycinbiosynthesisis25。C．Vancomycinfermentationneedshighdissolvedoxygenandisnotverysensitivetoshearingstrength．Withtheoptimalfermentationm