简便快速的PCR技术

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1、简便快速的PCR技术依赖核酸序列的扩增技术(NucleicAcidSequence-BasedAmplification；NASBA)反应体系：缓冲溶液AMV逆转录酶T7RNA聚合酶RNaseH引物(下游引物5'端带有T7RNA聚合酶启动子序列)。依赖核酸序列的扩增技术(NucleicAcidSequence-BasedAmplification；NASBA)原理：靶RNA经AMV逆转录，形成RNA:DNA杂交体RNaseH降解杂交体的RNA，剩下单链DNAAMV以其为模板,合成含T7RNA聚合酶启动子的双链DNAT7RNA聚合酶以其不断转录出靶RNA进入新一轮扩增循环产物主

2、要为反义单链RNA、RNA:DNA杂交体和双链DNA。依赖核酸序列的扩增技术(NucleicAcidSequence-BasedAmplification；NASBA)特点：可直接扩增特异性单链RNA整个反应不需PCR仪，无需温度循环，没有高温变性步骤，不会受到外来双链DNA的污染。反应速度快，忠实性好，特异性强，敏感性高。加入变性步骤，也能扩增双链DNA。环介导等温扩增技术(loop一mediatedisothermalamplification，LAMP)反应体系:缓冲液具有链置换特性的DNA聚合酶dNTP模板DNA能够识别靶DNA6个特异序列的4条引物。引物为2条内引物

3、和2条外引物环介导等温扩增技术(loop一mediatedisothermalamplification，LAMP)哑铃状模板合成阶段引物FIP首先和F2c结合启动互补链的合成，形成双链结构(图1b)。F3再和F3c结合，启动链置换反应，释放出1条FIP连接的互补链，在其一端能够形成环状结构(图1d)。这条单链DNA，又可作为模板，在另一端分别结合BIP和B3，合成1条双链，并置换出1条哑铃状的DNA(图1f)。哑铃结构很快与其一端F1c和F1互补，而由自我引物延伸机制合成1种双链的茎环结构DNA(图1g)。这种茎环结构的双链DNA是循环反应的原料。循环反应阶段FIP和双链茎

4、环结构DNA(图Ig)中的环状结构结合，形成1种有缺口的过渡性茎环结构DNA，该结构在茎上含有靶序列的1个额外反向复制序列，在对面的末端，通过BIP形成1个环状结构。在随后的自我引物置换延伸合成过程中，在内引物作用下，开始循环反应，茎的长度和环的个数都逐渐增加，最后的产物为茎环DNA组成的混合物，即含有若干倍茎长度茎环结构和类似花椰菜的结构(含有在同一链上由退火形成的，在靶序列的交替反向重复序列之间的多重环状结构)。环介导等温扩增技术(loop一mediatedisothermalamplification，LAMP)扩增结果判定：有3种判定方法1、琼脂糖电泳后，用EB或SY

5、BRGreenI染色检测。2、产物中加入Mg+试剂，肉眼观测副产物焦磷酸镁沉淀：阳性-液体浑浊，静置有白色沉淀。3、产物中加SYBRGreenⅠ，肉眼观察颜色反应：绿色阳性，橙红色阴性。优点灵敏度高能检测到比PCR低10倍的拷贝数。用3一5个细胞样本就可进行动物胚胎性别鉴定。特异性强LAMP引物需与靶序列上的6个特异部位准确结合，因此能获得比PCR更高的特异性。速度快LAMP是恒温扩增反应，没有PCR反应中温度变化的耗时，在30-60min内即可完成反应过程。另外，增加环引物还可缩短时间，大大提高了检测的效率。设备简单LAMP反应只需一个简单的恒温器。产物检测便捷LAMP反应

6、时产生大量的焦磷酸根离子，能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可根据反应休系中是否形成白色沉淀来定性判断。