EGFR基因突变检测试剂盒说明书

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1、人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书【产品名称】通用名：人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名：DiagnostickitforMutationsofHumanEGFRGene(FluorescencePCRAnalysis)【包装规格】20测试/盒【预期用途】表皮生长因子受体（EGFR）属于I型酪氨酸激酶受体，定位于细胞膜上。EGFR被表皮生长因子（EGF）等配体激活后，将信号传导至胞内，调控细胞的生长、增殖、转化等生理过程。EGFR位于染色体7p11.2，由原癌基因C-erbB-1编码，包含28个外显子

2、，其中外显子18～24编码受体酪氨酸激酶功能区。研究表明该区域内发生基因突变与吉非替尼等靶向药物的反应性相关。这类药物的作用机制主要是通过抑制EGFR胞内磷酸化而阻滞传导，抑制肿瘤细胞的增殖，实现靶向治疗。EGFR基因突变主要是19外显子的缺失突变和21外显子的L858R点突变，占突变总数的90%以上。19外显子的缺失突变集中于746-753位密码子，其中2种E746_A750del（2235_2249del15和2236_2250del15）最常见。19，21外显子的这些突变造成EGFR胞内酪氨酸激酶功能区的结构改变，提高EGFR与靶

3、向药物的结合能力，使靶向药物疗效更好。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》数据，亚洲人非小细胞癌EGFR突变率高达30~40%，回顾性研究报道显示，使用厄洛替尼或吉非替尼后肿瘤缓解的非小细胞肺癌患者大约90%携带突变，而未缓解者则无突变。本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于EGFR基因19、21外显子多种突变的定性检测，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤患者制定用药方案。【检验原理】本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术、野生型

4、基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测EGFR基因19、21外显子的14种突变（表1）。ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物组（共6条ARMS上游引物，包括5条检测19外显子突变和1条检测21外显子突变的引物）和2条下游引物，对存在突变的EGFR基因19、21外显子的靶序列进行多重PCR扩增，并利用分别标记有HEX荧光基团——BHQ1淬灭基团和FAM荧光基团——BHQ1淬灭基团的两条Taqman探针分别实现对19，21突变外显子扩增产物进行检测。因为采用了野生型基因扩增抑

5、制剂，使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型EGFR基因，降低了试剂盒对基因组样本的DNA浓度要求，提高了检测灵敏度。为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长度与EGFR目标片段相似，均为100bp左右，内控探针采用标记ROX荧光基团——BHQ2淬灭基团的Taqman探针对内控基因扩增产物进行检测。内控引物、探针及内控基因对ARMS体系的扩增效率无影响。阳性对照品是一种扩增效率最低的EGFR基因19外显子L747_P753>S突变质粒与野生型人类基因组DNA的混合物，用于PCR扩增

6、的外质控。表1本产品检测EGFR基因突变外显子突变名称碱基变化外显子突变名称碱基变化19E746_A750del2235_2249del1519L747_E749del2239_2247del919E746_A750del2236_2250del1519L747_T751del2239_2253del1519E746_T751del2236_2253del1819L747_S752del2239_2256del1819E746_T751>A2237_2251del1519L747_T751>S2240_2251del1219E746_S

7、752>A2237_2254del1819L747_T751del2240_2254del1519E746_S752>D2238_2255del1819L747_T751>P2239_2251>C19L747_P753>S2240_2257del1821L858R2573T>G【主要组成成份】本试剂盒包含PCR反应液I、PCR反应液Ⅱ和对照品等3管试剂。PCR反应液I包含外显子19突变扩增用5+1条引物对和1条探针（HEX标记），浓度20~100pM，19外显子野生型基因扩增抑制剂，浓度1200pM；外显子21L858R突变扩增用1对引

8、物、1条探针（FAM标记），浓度20~100pM，和21外显子野生型基因扩增抑制剂，浓度800pM；内控基因扩增用1对引物和1条探针（ROX标记），浓度20~100pM。2+PCR反应液Ⅱ包含0.1U/μl