菌丝霉素NZ2114基因在毕赤酵母中表达及中试发酵研究

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1、试验研究2015年第36卷第16期总第493期菌丝霉素NZ2114基因在毕赤酵母中表达及中试发酵研究1，231，21，21，21，21，2■叶滔杨静美闫凯冯蓓逯佩凤孙丹丹周玉岩（1.广东海纳川生物科技股份有限公司，广东佛山528515；2.广东省兽药与饲料添加剂工程技术研发中心，广东佛山528515；3.仲恺农业工程学院，广东广州510225）摘要：构建表达菌丝霉素NZ2114蛋白的真核重组表达质粒pPicZα-NZ2114，并转化毕赤酵母菌GS115，Zeocin抗性筛选阳性重组子，通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得菌丝霉素NZ2

2、114组成型表达菌株，并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌毕赤酵母菌GS-115/pPicZα-NZ2114的50L中试发酵研究。结果表明，本实验成功实现了菌丝霉素NZ2114基因在毕赤酵母GS115中的组成型表达pPicZα-NZ2114，Tricine-SDS-PAGE分析显示，在4.4kDa处有明显的目的条带，工程菌经50L发酵罐诱导培养96h后取上清，对金黄色葡萄球菌CMCC26003有明显的抑制作用。菌丝霉素NZ2114基因在毕赤酵母中表达的方法在本研究中成功应用，中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。关键词：菌丝霉素NZ2114基因；毕赤酵母；发酵；抑菌活性

3、doi:10.13302/j.cnki.fi.2015.16.012中图分类号：Q939.9文献标识码：A文章编号：1001-991X（2015）16-0054-06ExpressionandpilotscalefermentationofplectasinNZ2114geneinPichiapastorisYeTao,YangJingmei,YanKai,FengBei,LuPeifeng,SunDandan,ZhouYuyanAbstract：DNAfragmentcodedplectasinNZ2114proteinwasclonedintopPicZα-NZ2114

4、andthere⁃combinantplasmidwastransformatedintoPichiapastorisGS115.ThetransformantswerescreenedbyZeocinandPCRamplificationofyeastcolonies.TheexpressionsupernatantwasanalyzedbyTricine-SDS-PAGE.Theantibacterialactivityofexpressionproductwasanalyzedbyagarosediffusionassay.Datasshowedthatthegene

5、ticengineeringPichiapastorisGS115/pPicZα-NZ2114,constitutiveex⁃pressedtherecombinantplectasinNZ2114,wassuccessfulconstructed.TheresultofTricine-SDS-PAGEanalysisofexpressionsupernatantsshowedthatthelinewithmolecularweightof4.4kDawascorrespondingtoNZ2114.Afterculturedfor96hin50Lfermenter,the

6、expressionsupernatantofthePichiapastorisGS115/pPicZα-NZ2114hadobviousantibacterialactivityonS.aureusCMCC26003,exceed0.0123~0.0163μg/mlampicillin.ConstitutiveexpressionandpilotscaleofplectasinNZ2114wasappliedsuccessfullyinthisstudy,whichlaidthefundationforthefuturelarge-scaleproduction.Keyw

7、ords：plectasinNZ2114gene；Pichiapastoris；fermentation；antibacterialactivity作者简介：叶滔，硕士，研究方向为饲料添加剂研究与开防御素（defensin）是广泛存在于生物体中的一类发应用。内源性抗菌肽（antibacterialpeptide），在一定诱导条通讯作者：周玉岩，博士，高级兽医师。件下，由宿主细胞特定编码基因产生的对抗外源性病收稿日期：2015-05-20原微生物的小分子肽类活性物质。它具有广泛的杀基金项目：广东省海洋渔业科技推广专项