稻瘟病菌对三个水稻品种无毒性的遗传分析及分子标记

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1、中国农业大学博士学位论文稻瘟病菌对三个水稻品种无毒性的遗传分析及分子标记姓名：张国珍申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：彭友良2002.6.1中文摘要建立良好的稻瘟病菌的有性杂交体系和优化培养条件是进行无毒性遗传分析的前提。本研究首先选用自然成熟的番茄榨汁和燕麦片作为培养基的主要组分，通过调节培养基pH值在5．5左右并添加o．1％CaCO，途径优化了稻瘟病菌有性世代形成的条件。显著增加了稻瘟病菌子囊壳形成的数量和子囊孢子的成活率。观察发现，虽然不同杂交组合间有一定差异，分离稻瘟病菌子囊孢子的

2、适宜时期，一般在子囊壳开始出现后7～18天之间：在此期间分离出的子囊孢子成活率最高可达85．5％。此外，还建立了一种分离单子囊孢子的简便易行方法。本研究组建了稻瘟病菌的9个有性杂交组合，从中共分离出500多个子囊孢子菌株，，分别测定了它们在相应水稻品种梅雨明、石狩白毛和爱知旭上的无毒性分离情况。f对亲本■组合(S1522xSl59)、回交组合(S1522×Z41)、无毒菌株与毒性菌株间的2个姊妹交(Z1—1)(Z1-6和Z1．1xZl-5)、毒性菌株间的4个姊妹交(Zl-5xZ28，Z1-5xZ41

3、，Z1-2xZl·6和7_A7xZ28)等组合后代在水稻品种梅雨明上的无毒性遗传分析发现，凡是无毒菌株与毒性菌株问杂交的后代在水稻品种梅雨明上的无毒性与毒性菌株分离比例为1：l，而毒性菌株与毒性菌株间杂交后代在梅雨明上均表现为毒性。结果表明：菌株S1522对水稻品种梅雨明的无毒性是由一个无毒基因控制的，命名为AVR-Pik。。对亲本组合P131xSl528后代在水稻品种石狩白毛和爱知旭上的无毒性遗传分析结果显示：杂交后代在这2个水稻品种上的无毒性与毒性菌株分离比例均为l：1，菌株P131对水稻品种石

4、狩白毛和爱知旭的无毒性分别由一个单基因控制，分别命名为AVR-Pii和一髓-P蛔。、、J。l为了获得与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pii和AVR-Pia连锁的分子标记，从近500个随机引物中筛选出2个引物OPl07和OPMl0，可以扩增出与无毒基因AVR-Pii连锁的标记，分厂别定名为OPl077∞和OPMl0IⅢ。雉研究克隆了这2个标记，核苷酸序列分别为700bp和1314bp。根据标记之一OPl077∞的宏苷酸序列设计合成了一对21个核苷酸的特异引物，对组合P131xSl528的98个子囊孢子后代菌

5、株进行了PCR扩增，除6个重组体外·凡是无毒菌株均能扩增出一条700bp的DNA条带，与原RAPD标记的大小相同．而毒性菌株则不能扩增出此条带。表明已经将RAPD标记OPl07，∞转化为SCAR标记。用引物OPMl0I对组合P13l×S1528的56个子囊孢子后代菌株进行了扩增，除3个重组体外。无毒菌株能够扩增出一条1314bp的DNA多态性条带，而毒性菌株没有此条带的扩增。二个标记OPl07700和OPMlolⅢ与目标无毒基因AVR-Pii间的遗传距离分别为6．53cM和5．66cM。在所筛选的近

6、500个随机引物中，没有发现与无毒基因AVR．Pia连锁的明显标记。／、本研究还克隆了一个与无毒基VR-P'a,m紧密连锁的RAPD标iE,OPEl214∞，核苷酸序列为1406bp。／据此设计合成了一对17个核苷酸的特异引物，对组合S1522xSl59的108个子囊孢子后代菌株进行J"PCR扩增，除2个重组体外，凡是无毒菌株都能扩增出一条1406bp的DNA条带，而毒性菌株无此条带的扩增，表明已经将此RAPD标记成功转化为SCAR标记。同时还用已有的另一对SCARgI物SC012对这108个子囊孢

7、子后代菌株进行了扩增，除5个重组体外，无毒菌株能够扩增出一条946bp的DNA条带，毒性菌株不能扩增出这一条带。确定2个标记OPEl21406和OPOl2946与目标无毒基因AVR-Pikm的遗传距离分别为1．89cM和4．86cM，它们位于目标基因的同一侧。f。关键词：稻瘟病菌：无毒基因；分子标记；品种特异性：遗传分析fIABSTRACTConstructionofthefavorablecrosssystemandincubatingconditionisthepreconditionforge

8、neticanalysisofgenesconferringavirulenceinMagnaporthegrisea．Atfirst，optimizationfurtheperfectstageproductionofM．griseawasinvestigatedinvitroThenumberofperitheciaandascospores，thepercentageofviableascosporesweremarkedlyincreasedwhenjuice