猪BMP15和BMPR1B基因的克隆和LHβ亚基基因的SSCP分析

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1、中国农业大学博士学位论文猪BMP-15和BMPR1B基因的克隆和LHβ亚基基因的SSCP分析姓名：王爱华申请学位级别：博士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：吴常信;李宁2002.6.1猪BMP一15和BMPRlB基因的克降和LH13业基基因的SSCP分析中文摘要本研究对猪LHB亚基基因除上游调控区以外的序列进行了PCR—SSCP分析。结果发现在该基因的三个外显子和3’调控区内没有任何单碱基多态性(singlenucleotideDolymorphisms，SNPs)位点，仅在内含子l的1367位点和内含子2的1823位点发

2、现2个多态性位点。对这两个位点在二花脸、约克夏、杜洛克和长白猪等群体的检测结果表明，由这两个位点的SNPs产生的等位基因具有品种特异性。最小二乘分析的结果显示这两个位点的变异对窝产仔数和窝产活仔数性状的影响差异不显著。各单倍体型中，AACI)和ABCD、AACD和AADD以及AACD和AACC单倍体型在窝产活仔数性状方而的差异性检验的P值均接近0．05的显著性水平，其它单倍体型间的差异不显著。本研刭利用PCR的方法，克隆得到了猪BMP—15基因6337bp的DNA序列。1在该序列中存在大量的热休克应答元件。猪与人和绵羊的B

3、MP15基因编码区核菅酸序列的同源性分别为82％}1J90％；猪的BMP15基因编码394个氨基酸的多肽，与绵羊的BMP—15蛋白的氨基酸同源性为87．3％，与人的氨基酸同源性为72．9％。猪的BMP15基因编码的成熟肽具有与人和绵羊相同的结构，即125个氨基酸的碳端成熟肽在RXXR蛋白酶剪切位点旁边，成熟肽中含有6个半胱氨酸。这表明BMP一15蛋白在不同物种之间具有较强的保守性j利用PCR—SSCP方法对猪BMP一15基因的部分序列进行了多态性分析。、结果显示在长白、约克夏和二花脸3个品种中，猪BMP。15基因在5’调控

4、区、外显子1和部分内含子中没有发现任何变异，在外显子2编码成熟蛋白之前的区域中也没有发现任何多态性位点，但是成熟肽编码区序列中存在三个多态性位点。它们分别是位于编码成熟肽核苷酸的第59位的A—G、第106位的c—T和第151位的A—G转换。第59位碱基的变异可使BMP．15蛋白的成熟肽第20位的谷氨酸突变为甘氨酸(E20G)；第106位的突变为一沉默突变：第15l位的核苷酸突变可使成熟肽第51位的天冬氨酰突变为天冬氨酸(N51D)。对这三个多态性位点在长白、约克夏、杜洛克和二花脸等群体中的检测结果表明：野生基因型(AA基因

5、型)在所有群体中都是优势基因型。建立最小二乘模型分析了猪BMP．15基因突变对猪繁殖性状的影响，结果表明：所发现的BMP．15基因变异对窝产仔数性状影响的差异不显著(P>0．05)。在窝产活仔数性状方面，AA基因型的最小二乘均值(11．05)大于AB基因型(编码成熟肽的第59位核苷酸的A—G的突变的杂合子)的最小二乘均值(10．27)，并且它们的差异接近显著水平(P=0．0967)。其它基因型个体之间的差异不显著(P>0．05)。’本研究利用RT—PCR的方法从猪的卵巢组织中克隆了猪BMPRIB基因的完整编码区序列并进行了

6、分析。懈到的猪BMPRIB基因的cDNA序列长为1806bp。同源性比较表明猪BMPRlB与人和绵羊BMPRlB基因的核苷酸序列的同源性都是90％，但猪与绵羊BMPRIB蛋白的氨基酸同源性(98．6％)略高于猪与人之间的同源性(98．2％)。’本研究利用斑点杂交的方法分析了成年香猪BMPRlB基因在不同组织中的表达分布，发现猪BMPRlB基因的杂交信号在所检测的所有组织中都可以检测到，其中卵巢、子宫和肝脏组织中的信号较强，在肺脏、肾脏和心脏组织中的杂交信号强度较弱。关键词：猪，BMP一15，BMPRIB，克隆：LH0：PC

7、R—SSCP。圳Ii壅!!查堂堕!：型壅：!堡苎一——ABSTRACTPCR—SSCPanalysiswasconductedonthewholenecleotidesequenceofporcineLHBgeneexcepttheupstreamregulationregionNopolymorphicsitewasfoundinthe3exonsand3’regulationregionButtherewere2polymorplficsitesinthe1367siteofintronIand1823siteofin

8、tron2DerectionofthemutationsinErhualian，Yorkshire．DurocandLandracepigs‘showedthattheallelesofthe2singlenucleotidepolymorphisms(SNPs)werebreedspecificThe