东亚飞蝗locustamigratoriamanilensis血蓝蛋白亚基1基因克隆和表达

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1、ClassifiedIndex:CODE:10075U.D.C.:NO:20091087ADissertationfortheDegreeofM.ScienceCloning,ExpressionoftheHemocyaninsubunittypeⅠGenefromLocustamigratoriamanilensisCandidate:GuanNiSupervisor:ProfessorYinHongAcademicDegreeAppliedfor:MasterofScienceSpecialty:BiochemistryandMolecular

2、BiologyUniversity:HebeiUniversityDateofOralExamination:June,2012摘要摘要血蓝蛋白是位于节肢动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白，脱氧状态为无色，结合氧状态为蓝色。昆虫拥有发达的气管系统，可以直接从大气中把气态氧运输到体内。因此，通常认为昆虫循环系统不需要专门的氧运输蛋白。直到最近才发现在许多表变态和半变态昆虫类型血淋巴中血蓝蛋白存在而在半翅目和全变态类型中则消失。节肢动物血蓝蛋白通常含有两个不同亚基1和2，亚基2在直翅目和竹节虫目中消失。近年来研究表明，血蓝蛋白是一种多功能蛋白，它不仅具有输氧功

3、能，而且还与能量的贮存，渗透压的维持以及蜕皮过程的调节有关。另外，血蓝蛋白还具有酚氧化物酶活性和抗菌功能，被认为是节肢动物中的一种重要的免疫分子。对直翅目东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis血蓝蛋白基因的克隆，表达及功能分析有助于我们揭示血蓝蛋白消失的原因，对进一步了解血蓝蛋白的功能和其在昆虫发育中的作用有重要意义。本研究主要完成了以下工作：(1)通过RT-PCR及RACE技术从东亚飞蝗L.m.manilensis体内克隆获得血蓝蛋白亚基1基因的cDNA序列LmiHc1，提交到GenBank数据库（登录号：HQ213937

4、)并对其核苷酸和编码的氨基酸序列进行了分析。LmiHc1基因cDNA全长2271bp,包含一个2016bp的完整开放阅读框(ORF)，根据ORF推导的LmiHc1多肽由654个氨基酸残基组成，SignalP3.0程序预测N端包括18个氨基酸残基的信号肽，LmiHc1成熟肽由654个氨基酸残基组成，理论分子量为77.9KDa，理论等电点为6.06。同源性分析表明，LmiHc1与沙漠蝗S.americana胚胎血淋巴蛋白核苷酸相似性(identity)达到94.7%。(2)系统发育重建结果显示，基于Hc1基因全序列构建的贝叶斯树可以解决直翅目的系统发育

5、关系问题：外群弹尾纲Collembola(S.curviseta)最先从树的根部分出，昆虫纲所有动物聚为一支，为一单系群；在昆虫纲内，从昆虫纲中最先分出的是最原始的石蛃目Archaeognatha(M.germanica)，其次是衣鱼目Zygentoma(T.domestica)，石蛃目和衣鱼目同属于昆虫纲中的无翅亚纲Apterygota；在有翅亚纲中，蜚蠊目与螳螂目和等翅目有较近的亲缘关系，且蜚蠊目是并系群。根据进化树，我们可以总结狭义昆虫纲中各类群关系为：((((((蜚蠊目，螳螂目，等翅目)(直翅目，竹节虫目))襀翅目)革翅目)衣鱼目)石蛃目)

6、。I摘要(3)以昆虫β-actin基因作为内参分子，利用半定量RT-PCR对东亚飞蝗L.m.manilensis虫卵不同发育阶段mRNA表达水平进行定量分析，结果表明在东亚飞蝗虫卵发育的不同阶段，LmiHc1基因均有表达。(4)利用基因重组技术，将血蓝蛋白亚基1重组入原核表达载体pET-DsbA，成功构建了东亚飞蝗LmiHc1基因的原核表达载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中37℃培养，IPTG终浓度为1mM诱导3h获得成功。SDS-PAGE蛋白电泳显示，融合蛋白分子量约为60KDa，目的条带与预期分子量一致，获得了重组菌分泌的LmiHc1原核表

7、达多肽。关键词血蓝蛋白东亚飞蝗克隆半定量RT-PCR原核表达IIAbstractAbstract+Hemocyaninsarecopper-containing(Cu)proteinsthattransportoxygeninmanyarthropodshemolymph.Itiscolorlesswhendeoxidizedandbluewhencombinedwithoxygen.Insectspossessanelaboratetrachealsystemthatenablestransportofgaseousoxygenfromtheat

8、mospheredirectlytotheinnerorgans.Therefore,thepresenceofspeci