HBsAb快速定量检测上转发光免疫层析试纸的研制及临床应用

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1、·中文论著摘要·快速定量检测HBsAb上转发光免疫层析试纸的研制及临床应用目的乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)是一种严重危害人类健康的致病因子，是慢性肝炎、肝硬变和肝细胞癌最重要的病因之一。据估计，全球有3亿人是HBV的持续携带者，其中1／3在中国。全球约45％的人口生活在慢性HBV感染的高风险地区，约20亿人感染HBV，每年有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌。我国属HBV感染高流行区，一般人群的乙型肝炎表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen，HBsAg)阳性率为9．75％。尽管疫苗接种卓有成效，但仍有部分人群对乙肝疫

2、苗无应答。诸多因素，包括衰老、吸烟、肥胖、性别和遗传因子等均与免疫应答的降低相关，男性无应答者的出现频率高于女性。因此，定量检测各类疫苗接种者在接种后的乙型肝炎表面抗体(hepatitisBsurfaceantibody，HBsAb)水平十分必要，特别是检测疫苗接种后的医务工作者，对防止HBV在医院内的传播具有重要意义。对于那些为防止因偶然因素导致母婴传播和接触传播而注射乙肝免疫球蛋白(hepatitisBimmunoglobulin，HBIg)的个体来说，定量检测HBsAb也十分重要。肝移植接受者为了预防乙肝，通常需要注射HBIg。为了有效预防乙肝的发生，血液中的HBIg水平应当高

3、于100mlU／mL。因此，开发血液中HBIg的定量检测技术也势在必行。上转发光(up—convertingphosphor，UCP)材料是一种含有稀土元素的亚显微陶瓷微粒，它的特殊组成和结构为其提供一个独特的光学特征，既在红外光激发下，可以发射可见光。这种能量上转现象使UCP成为一种能够摆脱荧光焯灭现象和样品自发荧光干扰的示踪物。UCP作为示踪物与免疫层析(1ateral．flow，LF)技术结合而成的上转发光免疫层析检测技术(UCPtechnology．basedLFassay，UPT．LF)为高敏感性的、精确的定量检测奠定了坚实的基础。目前已经开发出多种UPT免疫层析试纸，并且

4、在违禁药品监控、核酸、INF7、血吸虫循环抗原、大肠埃希菌、鼠疫耶尔森菌、呼吸道合胞病毒等的敏感检测中显示了UCP示踪物的作用。但迄今为止，在国内外的相关文献中，尚未发现UCP．LF在HBV血清标志物定量检测方面的应用。本研究的目的是研制一种用于定量检测HBsAb的上转发光免疫层析技术，并通过对临床样品的检测评估其应用的可行性。实验方法利用PCGENE计算机软件，分析已知的HBV基因组序列，结合国内克隆的HBsAg编码区序列设计、合成引物。扩增目的基因的，回收、纯化PCR产物，与pGEM．Teays载体的TA克隆连接。从亚克隆质粒载体中获取S基因，与表达载体pRESET．A的连接，采

5、用DH5a感受态细菌试剂盒转化连接产物，筛选及鉴定重组克隆。挑取转化工程菌单菌落，接种于LB(含氨苄青霉素50I_tg／ml和氯霉素35}tg／m1)液体培养基，37℃振荡培养过夜。培养物中加入异丙基硫代半乳糖昔(IPTG)至终浓度为lmol／L，37。C振摇培养，诱导培养4h。收集细菌，选择最佳IPTG诱导浓度。Tris．甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)分析表达产物，大量表达工程菌，采用HisTrap亲和层析柱纯化His融合蛋白，Westernblot分析表达产物。UCT免疫层析试纸主要是由五部分组成，包括：样品挚、结合垫、分析膜、吸水垫和粘性底衬。样品垫、结合垫

6、、分析膜和吸水垫通过粘胶固定于粘性底衬上。HBsAg和羊抗HBsAg分别包被在分析膜上作为检测带和质控带。将UCP-HBsAg结合物固化在结合挚上，特殊的终点指示带能显示颜色变化，用以提示免疫层析反应的结束。将制备完成的测试条放入塑料盒式存储器内，样品垫、分析膜(检测带和质控带)、吸收垫(终点指示带)的连接部分重叠，分别对应加样孔、结果扫描窗和终点指示窗。将70“L血清样品和70“L样品处理缓冲夜混合后，加到加样孔中。当样品垫被浸透后(约在加样后10min)，样品的流动将停止，而此时在吸水垫末端的终点指示带将由白色转变为蓝色，提示UPT传感器读取结果。UPT传感器扫描在分析膜上的检测

7、带和质控带，以采集数据。阳性样品将出现2个主要的峰值信号(检测带和质控带)，而阴性样品将只出现一个单一的主要峰值信号(只有质控带)。对应检测带和质控带的峰值区域分别命名为T和C，T／C的比率即为检测结果。在2本研究中是采用本法检澳tJ52份健康献血者的血清样品，以确定其cut．O髓。本研究中，同时应用目前常规检i贝lJHbsAb的二种方法抗原夹心法ELISA和雅培酶促免疫荧光试验(AbbottAxsymAUSABassay，AUSAB)检测HBsA-b，以