基于荧光硅球的克伦特罗快速定量免疫层析试纸条的研制.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第11期2011年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl647l652基于荧光硅球的克伦特罗快速定量免疫层析试纸条的研制李怀明L赖卫华许恒毅徐波罗薇魏华L王水兴熊勇华(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047)(南昌大学中德联合研究院，南昌330047)(无锡中德伯尔生物技术有限公司，无锡214174)摘要采用荧光硅球为标记物制备r快速定量检测克伦特罗(CLE)的荧光硅球免疫层析试纸条。通过正交实验得到最优荧光硅球抗体标记量、硅球垫抗体标记物用量以及检测线

2、抗原浓度。在最优条件下，试纸条线性范围为0．28~3．3g／L。猪尿样品CLE加标回收率为81．7％～101％，表明此试纸条可实现猪尿中CLE残留的快速定量检测。关键词荧光硅球；定量检测；克伦特罗；试纸条1引言克伦特罗(Clenbuterol，CLE)是一种肾上腺素受体激动剂，在畜牧生产中大剂量使用可明显提高瘦肉率]，俗称为“瘦肉精”。人食用残留有CLE的肉制品后，对肝、肾等内脏器官会产生毒害作用，严重者会引起死亡】。因此，各国政府都禁止CLE用作肉用动物的饲料添加剂，我国农业部也明文禁止在饲料中添加CLE，并规定在动物性食品中不得检出CLE。目前，分析CL

3、E残留的常用方法有酶联免疫吸附法(ELISA)[41、气相色谱串联质谱法(GC—MS)、高效液相色谱法(HPLC)[61和液相色谱串联质谱法(LC—MS)17]等。上述方法具有灵敏、准确、特异等优点。但是，存在检测方法复杂，费用昂贵等缺点，不适于市场现场监督。胶体金免疫层析试纸条法因操作简便、检测快速、费用低等特点，已广泛用于食品安全现场初筛检测Ⅷ。但以胶体金为标记物的检测方法灵敏度相对偏低，且只能用于定性或半定量分析。而以量子点、上转磷光纳米粒子及荧光硅球为代表的新型发光标记材料在生物分析中可去除本底干扰，是免疫层析定量检测的备选标记物。目前，荧光硅球在氯

4、霉素及呋喃唑酮类药物残留检测试纸条中已有应用[11~13]，表现了较高的灵敏度，但仍仅用于定性分析。本研究以荧光硅球标记抗克伦特罗的单克隆抗体(Anti—CLEmAb)作为指示CLE分子的荧光标记物，制备了一种可用于定量检测猪尿中CLE的免疫层析试纸条。2实验部分2．1仪器与试剂XYZ3000点膜仪(Bio—Dot公司)；透射电镜(日本JEOL公司)；Zeta电位分析仪(英国马尔文公司)；试纸条读取仪(无锡中德伯尔生物技术有限公司)；荧光分光光度计(日本日立公司)；Milli—Q水处理系统、硝酸纤维膜(NC膜)、荧光硅球垫、样品垫、吸水纸及PVC底板(美国M

5、illipore公司)。羧基修饰的荧光硅球(羧基密度625~tmol／g)、Anti—CLEmAb以及CLE—BSA(无锡中德伯尔生物技术有限公司)；克伦特罗、莱克多巴胺(Ractopamine)、沙丁胺醇(Salbutamo1)、塞曼特罗(Cimatero1)、西布特罗(Cimbutero1)、特布他林(Terbutaline)、卜乙基一(3一二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HC1)购自Sigma公司；驴抗鼠二抗(艾美捷科技有限公司)；其它试剂均为分析纯(中国医药集团上海试剂公司)。201卜04-13收稿；201i_0523接受本文系国家自然科学

6、基金(No．30960301)、江西省教育厅产学研课题(No．GJJ10009)及江西省研究生创新专项资金(No．YC10A029)资助E—mail：yhxiongchen@163．com分析化学第39卷2．2荧光硅球标记Anti-CLEmAb条件的优化采用EDC一步法将羧基化荧光硅球与抗克伦特罗的单克隆抗体的氨基偶联，在10mg荧光硅球中加入18mL0．01mol／LpH值为6．0的PB或PBS缓冲液，室温下分别加入25～175ggCLEmAb溶液，然后加入与荧光硅球羧基等同摩尔数的EDC·HC1，室温搅拌反应2h后，加入封闭剂1％BSA、0．1％PEG或

7、0．1mol／L甘氨酸封闭30min；以8000r／min离心5min，弃上清液，以20mL0．01mol／LPB缓冲液洗涤沉淀一次，2mLPB重悬后，4℃保存备用。2．3CLE荧光硅球试纸条最佳条件的优化以荧光硅球抗体标记量、荧光硅球量以及T线CLE—BSA浓度为因素，设计三因素三水平正交实验优化荧光硅球试纸条检测性能，具体见表1。通过正交实验选取阴性样本显色正常，阳性样本IC。(50％竞争抑制率)值最低的条件为试纸条最佳工艺条件。表1三因素三水平正交实验表Table1OrthogonalL。(3)testdesign2．4荧光硅球试纸条的组装采用Bio—

8、DotXYZ3000点膜仪，将CLE-BSA抗原及驴