阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)的诊断指南(流式细胞术)

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1、流式细胞术诊断并监测阵发性睡眠性血红蛋白尿症和相关疾病指南背景：阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种特殊的获得性克隆性造血干细胞疾病，该疾病是由于PIGA基因体细胞突变，导致连接细胞膜的GPI相关锚蛋白缺失所致。流式细胞术是检测GPI相关锚蛋白缺失的方法之一，同时也是诊断PNH所必需的检测指标。然而到目前为止，对于运用流式细胞术检测GPI相关锚蛋白缺失方法还没有标准化、规范化。方法：在本论文中，我们将提出一致方案，介绍运用流式细胞术检测PNH的规范程序。结果：我们通过临床症状和对数据的分析、结

2、果报告对病例提出综合意见。但分析中，主要集中在对分析过程的重要性。本文将区分常规分析（定义为：缺失细胞占1％或更多）和高灵敏度的分析（缺失细胞仅占小于0.01％的PNH细胞）。其中如何设计抗体组合和设门对这两种分析都是非常重要的，本文将做详细介绍。我们将通过对白细胞和红细胞的检测，以及各自的检测优势来讨论并评估PNH患者人群。我们目前提供的步骤仍需要进一步完善，使其成为高灵敏度的检测技术，包括需要明确：试剂浓度；PNH克隆细胞在正常人群的发生率（背景），并讨论此技术的缺点，因为此缺陷将可能影响到结

3、果解释。结论：本论文可适用于对PNH感兴趣和刚开始建立检测PNH克隆细胞的实验室，使其建立一个比较完善的实验流程；也可用于已开展此检测项目，以提高其该实验室检测技术和报告水平。背景阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）是一种罕见的造血干细胞疾病，该疾病自19世纪初即被确认为一个具有独特临床症状的疾病（1,2）。在疾病的发展过程中，PNH有三个显着的临床特点，但是这三个特点的个体差异很大（3-5）。首先，以补体介导的血管内溶血为主要临床表现，包括：吞咽困难，嗜睡，勃起功能障碍（ED），慢性肾功能衰竭，肺动

4、脉高压，贫血，和血红蛋白尿。其次，具有形成血栓的倾向，该血栓不仅可发生在四肢，还好发于具有特殊部位，如肝门（Budd-Chiari综合征），脾，肠系膜静脉。第三，有发展为骨髓造血功能衰竭的潜在风险，所有患者当疾病发展到一定程度都有可能发生，也是疾病发展的终末期，表现为免疫介导的严重的再生障碍性贫血。关于本病的一个估计发病率仅为每百万个人每年新发病例1.3。虽然PNH很早就被归为获得性的溶血性贫血，但是它确实影响到所有的血细胞谱系，因此，被认为获得性的造血干细胞疾病，其病理生理机制为X-连锁的PIG

5、A体细胞突变,导致部分或绝对GPI相关锚蛋白缺失。PNH干细胞被认为是逃避了免疫介导的破坏，而这种免疫介导会破坏正常的骨髓干细胞，从而PNH的干细胞成为细胞生成的主要来源。CD55—GPI相关锚蛋白的一种（衰变加速因子），其作用为防止C3转换酶在补体级连反应中的形成并增加其不稳定性；CD59（反应性溶血膜抑制物），抑制膜攻击补体复合物的形成，CD55,CD59共同反映了PNH患者的红细胞对补体的敏感性。因此无论发生急性血管内溶血或是慢性血管内溶血，对于PNH患者来说，CD55,CD59缺失都是较典

6、型的。而在一些PNH病例，只是GPI抗原部分缺失，这是因为有些类型的PIGA突变，是可以合成一些GPI相关锚蛋白。通过以上分析，了解了关于PNH的成因及病理学特点，及其与骨髓造血功能衰竭的关系，但是对导致骨髓造血功能衰竭及发生溶血的病理生理机制还不是很明确。尽管PNH是罕见的，但是合适的筛选和准确的诊断还是非常重要的，因为PNH的是一种慢性疾病，疾病的长期存在，对患者的生活质量及一些患者的生命将产生很大的影响。在过去几年中，对PNH治疗方案的新发展（9）和一些成功的临床（10）试验，已经极大地改善

7、了患者的生活质量，使溶血性贫血的患者溶血发生率降低，血栓形成风险减小，输血要求减少（10-13），例如人造单克隆抗体，它可以抑制终端的补体蛋白C5（(Eculizumab;AlexionPharmaceuticals,Cheshire,CT)。这使得PNH的筛查实验和准确的诊断成为临床实验室优先考虑重要工作。国际PNH的兴趣小组（I-PIG）已经提出关于PNH的分类方案，它包括三个主要类别，涵盖了该疾病主要的临床表现谱（14）：（1）典型PNH，有溶血和血栓形成倾向患者；（2）其他主要衰竭，如再生

8、障碍性贫血或骨髓增生异常综合征;（3）亚临床PNH患者，其中有少量PNH的克隆，但没有溶血或血栓形成的临床或实验室证据。整个分类方案整体目的是提供一个共同的国际术语。PNH诊断由于PNH起初被认为是溶血性贫血的一种，因此，最初PNH的检测主要集中检测红细胞相关的实验：如Ham实验和蔗糖溶血实验。这两种检测手段都提示红细胞对补体介导的溶血敏感度增加(15–18)。但二者都不是特异性检测，且操作不方便。补体敏感性溶血实验的特异性测试，是通过检测不同浓度的补体造成不同程度的溶血来反映;实