基因工程育种技术

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1、专业资料基因工程育种技术基因工程又称重组DNA技术，是指将一种或多种生物的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物(受体)，使受体按人们的愿望表现出新的性状。基因工程诞生于1972年，在其后几年中由于担心重组生物对环境安全的影响，基因工程技术的发展曾一度受挫。但随着人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行有效的安全性改造，以及相应的DNA重组实验室设计和操作规范的建立，再加上重组DNA技术的巨大应用潜力的诱惑，重组DNA技术迅速发展，现在，基因工程已成为生物学实验室的一项常规技术，并广泛应用于医药、农业、食品、环保等许多领域。第一节基因工程的基本

2、过程和原理基因工程最典型的操作如图6-1所示一般包括以下三个步骤：1．外源DNA的获得与酶切；2．外源DNA与经同样酶切的载体的连接；3．连接产物转化受体细胞及阳性转化子的筛选；图6-1基因工程的基本过程word完美格式专业资料由图6-1可见，基因工程操作过程需要以下基本材料：外源DNA(基因)、载体、DNA体外重组用的酶以及宿主细胞。一、载体外源基因导入受体细胞一般都要借助于载体，基因工程中最常用的载体是质粒载体。图6-2所示pUC19就是最常用的载体之一。图6-2载体pUC19及其多克隆位点载体一般含有以下几个基本元件：(一)复制原点载体在宿主细胞中要

3、独立存在则应具有独立复制的能力，复制原点又称为复制起始位点(Origin，简称ori)，控制载体复制。不同生物的载体复制原点不同，同一种生物的不同载体拷贝数和稳定性有很大差别，这主要决定于载体的复制原点的性质。图6-2所示的pUC系列载体的复制原点是pAM1的一个突变体，在合适的大肠杆菌宿主细胞中(如大肠杆菌JM109)其拷贝数可达500。整合型载体的复制原点被整合位点的同源序列替代。(二)筛选标记一般是载体上的一段编码酶的基因，能赋予转化子新的性状，便于转化子的筛选。载体pUC19的筛选标记是β-内酰氨酶基因（常简写为bla或Ampr），能分解氨苄青霉素

4、中的β-内酰氨环使其失活，因此在含氨苄青霉素的平板上，只有含质粒的转化子能生长而不含质粒的宿主细胞不能生长。抗药性是细菌载体中最常用的筛选标记，除氨苄青霉素抗性外，卡那霉素、氯霉素、四环素等抗性也常用作载体的标记。另一类常用的标记是营养缺陷型互补标记，在真核生物载体中更常用。(三)多克隆位点（multicloningsite,简写为MCS）载体中用于插入外源基因的区域，往往是一段人工合成的序列，这一序列中含多种限制性核酸内切酶的识别位点。图6-2下方即为载体pUC19的多克隆位点，这一段序列可被十多种限制性内切酶识别，酶切后能产生多种黏性末端，有利于外源D

5、NA片断的插入。除质粒载体，cosmid、细菌人工染色体(BacterialArtificialChromosome，BAC)、酵母人工染色体(YeastArtificialChromosome，YAC)word完美格式专业资料等也是基因工程中常用的载体，这些载体适合于插入长片段的外源DNA，主要在构建基因库时使用。二、DNA重组用酶DNA重组过程最常用的酶是限制性核酸内切酶和连接酶，这两种酶几乎应用于DNA重组的所有实验中。(一)限制性核酸内切酶（RestrictionEndonuclease）目前已发现的限制性核酸内切酶有600多种，根据性质不同分为3

6、类，基因工程中常用的是II类酶，这类酶有比较专一的识别和切割位点，通常专一性的识别DNA序列中4～6个碱基的回文序列。表6-1列出了几种最常用内切酶的识别序列。表6-1常用的限制性核酸内切酶限制性内切酶识别位点产生的黏性末端BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’5’-G-3’3’-CTTAA-5’EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-G-3’3’-CTTAA-5’HindIII5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’5’-A-3’3’-TTCGA-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-

7、5’5’-CTGCA-3’3’-G-5’SalI5’-GTCGAC-3’3’-CAGCTG-5’5’-G-3’3’-CAGCT-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’5’-CCC-3’3’-GGG-5’KpnI5’-GGTACC-3’3’-CCATGG-5’5’-GGTAC-3’3’-C-5’限制性内切酶和后面介绍的连接酶都有商品出售，一般在需要时向有关厂商索取产品目录，再根据实验需要决定使用哪些酶。(二)连接酶DNA连接酶催化的基本反应是将DNA双链上3’-羟基和5’-磷酸基共价结合形成3’－5’磷酸二酯键。基因工程中最常用的DNA

8、连接酶是T4-DNA连接酶，反应机理如图6-3所示。图6-3T4-