基因工程育种微生物遗传育种

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1、1第五章基因工程育种Geneticengineering基因工程是将不同生物的基因在体外人工剪切组合，并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。2奠定基因工程的三项关键技术DNA的特异切割Smith和Nathans获1978年诺贝尔医学奖DNA的分子克隆Berg（1972）将猴病毒SV40DNA与λ噬菌体基因融合，成功构建重组DNA；Cohen和Boyer（1973）将质粒pSC101与R的tetrkmr基因融合，并将重组DNA转化E.coli，首次实现了DNA的分子克隆。DNA的快速测序Sanger(1975)

2、的酶法、Gilbert(1977)的化学法DNA快速测序技术1980年诺贝尔化学奖：Berg,Gilbert,Sanger3分离或合成基因；通过体外重组将基因插入载体；将重组DNA导入细胞；扩增克隆的基因；筛选重组体克隆；对克隆的基因进行鉴定或测序；控制外源基因的表达；得到基因产物或转基因动物、转基因植物基因工程操作的主要步骤4第一节基因克隆的酶学基础一、限制性核酸内切酶restrictiveendonuclease核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。核糖核酸酶(RNase)与脱氧核糖核酸酶(DNase)核酸外切酶：exonucle

3、ase核酸内切酶：endonuclease51、寄主控制的限制与修饰作用（1）寄主控制的限制作用(Restriction)作用：破坏外源DNA，使之迅速降解机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列并进行切割（2）寄主控制的修饰作用(Modification)作用：保护自身的DNA，使之不受限制机制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。62、限制性核酸内切酶的类型特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型功能限制、修饰限制限制、修饰蛋白质结构3种不同亚基单一成分2种不同亚基所需辅助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM识别序列EcoB:TGA(N)8TG

4、CT4~8bp,旋转对称EcoPI:AGACC切割位点距识别位点至少1000kb处随机切割在识别序列内（或附近）距识别位点3’-端24~26bp处73、限制性核酸内切酶的命名用产生菌的属名一个字母(大写，斜体)＋种名两个字母(小写，斜体)[＋菌株名一个字母]＋编号（罗马数字）[例]EcoRI,EcoRII：从E.coliRye13菌株中获得HindI，HindII，HindIII：从Haemophilusinfluenzaed菌株获得84、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特征（1）识别序列：一般4~8bp，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构(palindromicstructure)例：AluI：5

5、’-AGCT-3’AsuI：5’-GGNCC-3’PstI：5’-CTGCAG-3’9（2）切割：产生平末端：SmaI5’-CCC↓GGG-3’3’-GGG↑CCC-5’产生3’-OH单链粘性末端:PstI5’-CTGCA↓G-3’3’-G↑ACGTC-5’产生5’-P单链粘性末端:EcoRI5’-G↓AATTC-3’3’-CTTAA↑G-5’1011酶剪切条件需要镁离子的存在，特定的酸碱度和离子强度。辅助条件：DTT、牛血清蛋白。抑制因子：杂蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐浓度。其它：甘油浓度等可以改变对序列的识别。12狭义：来源不同但识别和切割相同序列的酶。HpaⅡ与MspI:

6、CCGG广义：来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同异功酶（neoschizomer）：SmaI和XmaI，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末端，后者切后产生粘性末端。（3）同裂酶(isoschizomers)13两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶BamHI:G↓GATCCBglⅡ：T↓GATCA（4）同尾酶(isoocaudamer)14二、DNA连接酶（DNAligase）催化两个双链DNA片段相邻的5’-P与3’-OH之间形成磷酸二酯键。1、体外DNA连接连接具有互补粘性末端的DNA片段连接具有平末端的D

7、NA片段先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，再行连接152、连接用酶（1）T4DNA连接酶：催化反应需要Mg+2,ATP催化粘性末端连接，效率较高催化平末端连接（2）大肠杆菌连接酶催化反应需要NAD+只能催化粘性末端的连接16减少载体自身连接的方法：脱磷酸；双酶切17三、反转录酶(reversetranscriptase)催化以mRNA为模板的cDNA的合成cDNA（compleme